高密度培养工艺对质粒菌质粒产量的影响

摘要

为通过优化质粒pUC57的复制起始位点，提高其在宿主菌中的拷贝数，利用随机突变PCR技术对质粒pUC57的复制起始位点进行了定向突变，发现突变后的质粒pUC57-Mu-Ori-kana(Mu代表突变)显示更高的拷贝数。采用分子克隆技术中的同源重组方法，将pUC57-Mu-Ori-kana作为载体，连接新的目的基因片段。通过使用商品化感受态细胞DH10B对质粒进行转化，发现质粒产量显著提升。经过传代稳定性验证，进一步在生物反应器中使用改良的MLB培养基对新质粒菌进行放大培养。最终，从发酵罐中取得的样本显示，质粒的终产量可达到600 mg/L。突变后的复制起始位点显著提升了质粒的拷贝数，挑取阳性单克隆测序，最终获得了两个不同的质粒目的片段序列。通过同源重组技术，将突变后的片段和未突变的片段与原始载体连接起来，对比发现，在相同的转化情况和提取工艺条件下，pUC57-Mu-Ori-kana提取量是原始pUC57-kana的1.5倍。此外，DH10B-pUC57-Mu-Ori-kana在生物反应器放大培养后，也得到了令人满意的产量。

关键词

复制起始位点 / 质粒拷贝数 / 生物反应器