扶正消积汤调控肠道免疫平衡对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长转移的抑制作用

The inhibitory effect of Fuzheng Xiaoji Decoction on the growth and metastasis of Lewis lung cancer in mice by regulating intestinal immune balance

摘要

目的 研究扶正消积汤对Lewis肺癌小鼠肿瘤抑制及肠道免疫平衡的调节作用。 方法 腋下接种Lewis细胞法建立肺癌小鼠模型并分为肺癌模型组，扶正消积汤低、中、高剂量组及阳性对照组，10只/组，扶正消积汤各剂量组按照6.5、13、26 g/kg灌胃扶正消积汤，阳性对照组按照25 mg/kg灌胃环磷酰胺，每日1次，连续28 d，计算肿瘤体积及肿瘤抑制率，测定IgG、IgA、IgM、外周血CD4⁺、CD8⁺比例及IL-4、INF-γ、IL-17A、Foxp3水平、肠道双歧杆菌、肠杆菌、乳酸杆菌及肠球菌菌落数、肿瘤组织E-cadherin、vimentin、β-catenin蛋白水平，检查肺组织病理。 结果 与肺癌模型组比较，扶正消积汤各剂量组肿瘤体积、CD8⁺细胞、IL-4、Foxp3阳性细胞比例、肠杆菌、肠球菌菌落数、vimentin、β-catenin蛋白显著降低（P＜0.05），肿瘤抑制率、IgG、IgA、IgM、CD4⁺及CD4⁺/CD8⁺值、INF-γ、IL-17A水平、双歧杆菌、乳酸杆菌菌落数、E-cadherin蛋白显著升高（P＜0.05），肺组织病理明显改善。 结论 扶正消积汤能够调控Lewis肺癌小鼠肠道免疫平衡，抑制肿瘤生长及转移，调节肿瘤微环境，改善免疫功能及肠道菌群，进而显著抑制小鼠肺癌进展。

Abstract

Objective To study the effect of Fuzheng Xiaoji Decoction in regulating the tumor inhibition and intestinal immune balance in mice with Lewis lung cancer. Methods A lung cancer mice model was established by armpit inoculation with Lewis cells and the model mice were divided into a lung cancer model group, the low-, medium- and high-dose groups of Fuzheng Xiaoji Decoction and a positive control group, with 10 mice per group. The TCM groups were given 6.5, 13 and 26 g/kg of Fuzheng Xiaoji Decoction by gavage respectively, while the positive control group was given 25 mg/kg of cyclophosphamide by gavage, once a day for 28 consecutive days. The tumor volume and tumor inhibition rate were calculated. The ratios of IgG, IgA, IgM, CD4⁺ and CD8⁺ in peripheral blood, the levels of IL-4, INF-γ, IL-17A and Foxp3, the number of intestinal Bifidobacterium, Enterobacter, lactobacillus and enterococcus colonies, and the protein levels of E-cadherin, vimentin and β-catenin in tumor tissue were determined, and the levels of lung histopathology was examined. Results Compared with the lung cancer model group, the tumor volume, the ratios of CD8⁺ cells, IL-4, Foxp3 positive cells, the number of Enterobacter, enterococcus colonies, the protein levels of vimentin, β-catenin in each group of Fuzheng Xiaoji Decoction at varying doses were significantly decreased (P<0.05), while the tumor inhibition rates, the values of IgG, IgA, IgM, CD4⁺ and CD4⁺/CD8⁺, the levels of INF-γ, IL-17A, the number of Bifidobacterium, lactobacillus colonies and the protein level of E-cadherin were significantly increased (P<0.05), and the levels of lung histopathology were significantly improved. Conclusion Fuzheng Xiaoji Decoction can regulate intestinal immune balance, inhibit tumor growth and metastasis, regulate tumor microenvironment, improve immune function and intestinal flora in mice with Lewis lung cancer, and then significantly inhibit the progression of lung cancer in them.

Graphical abstract

关键词

扶正消积汤 / Lewis肺癌 / 肠道免疫平衡 / 肿瘤抑制

Key words

Fuzheng Xiaoji Decoction / Lewis lung cancer / intestinal immune balance / tumor inhibition

肺癌作为临床中常见的呼吸系统肿瘤疾病，其临床表现主要为咳嗽、咯血等，无典型临床特点，发病过程较为隐蔽，因此肺癌患者确诊时大多已到晚期，给肺癌的治疗带来了较大难度^[1]。目前，临床中对于肺癌的治疗主要以手术治疗、化疗及放疗为主，其表现出有效率低、不良反应大等缺点^[2]，所以肺癌治疗药物的研发仍是当前的工作重点之一。研究^[3]表明，肠道免疫平衡在肺癌的发生及进展中占据重要地位，其与肺癌的发生及转移密切相关。扶正消积汤是以中医学理论为基础，由党参、黄芪等药材组成的方剂，在肺癌治疗中具有较大潜力^[4]。然而，扶正消积汤对肺癌治疗的药理作用及机制目前尚不明确，因而扶正消积汤的临床应用受到巨大限制。因此，本实验通过研究扶正消积汤对Lewis肺癌小鼠肿瘤抑制作用及对肺癌小鼠肠道免疫平衡的调节作用，为扶正消积汤的药理作用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞

50只C57BL/6小鼠，雄性，6～8周龄，体质量18～22 g，购自新疆医科大学实验动物中心，生产许可证号SCXK（新）2023-0001。小鼠饲养于动物房，温度20℃～25℃，相对湿度40%～70%，明暗交替光照/12 h。本研究动物实验通过新疆医科大学第七附属医院医学伦理委员会审核批准（伦理批号：20231018-03），严格按照《实验动物管理条例》进行。

1.2 药品及试剂

扶正消积汤由党参（批号210819）、黄芪（批号210918）、茯苓（批号220325）及白花蛇舌草（批号220919）各30 g，薏苡仁（批号220826），仙鹤草（批号220708）各15 g，白术（批号220903）12 g，陈皮（批号220705）10 g，炙甘草（批号221013）3 g组成，药材饮片购自北京同仁堂中药饮片有限责任公司。中药饮片常规煎煮后过滤，蒸发浓缩，制成生药含量为3 g/mL的制剂。环磷酰胺（标准品，纯度≥98%，货号IC8080）购自北京索莱宝科技有限公司；PerCP/Cy5.5-INF-γ抗体（货号505821）购自北京盛科博源生物科技有限公司；APC-Cy7-CD3（货号05122-77-25）购自维百奥北京生物科技有限公司；FITC-CD4（货号11-0042-82）购自上海研卉生物科技有限公司；PE-IL-4（货号PE-30026）购自武汉菲恩生物科技有限公司；APC-IL-17A（货号E-AB-F1199UE）、APC-CD25（货号E-AB-F1102UE）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；PE-Cy7-Foxp3（货号60-5773-U025）购自朗智上海生物科技有限公司；IgG（货号DDM1505A）、IgA（货号DDM1504A）购自西宝生物科技（上海）股份有限公司；IgM（货号XFM20900）购自上海信帆生物科技有限公司；HE试剂盒（货号BP-DL001）购自南京森贝伽生物科技有限公司；兔抗体GAPDH（货号ABL1021）购自亚科因（武汉）生物技术有限公司；E-cadherin（货号ab76319）、vimentin（货号ab92547）、β-catenin（货号ab305261）购自艾博抗（上海）贸易有限公司。

1.3 设备与仪器

CLARIOstar PLUS酶标仪购自德国BMG LABTECH公司；Microfuge 20高速离心机购自贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司；GIS-500凝胶成像仪购自杭州米欧仪器有限公司；FACSCanto II流式细胞仪购自美国BD公司。

1.4 造模、分组及给药

Lewis细胞使用含有10%胎牛血清，不含青-链霉素的DMEM培养基，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养，每日更换新鲜培养基，待细胞融合度达80%进行传代。取对数生长期的Lewis细胞，调整细胞密度为1×10⁷个/mL，参照文献方法^[5-6]，取0.2 mL Lewis细胞接种于小鼠右腋皮下，10 d后以小鼠右腋皮下可触及持续增长的肿块，且体积≥75mm³视为造模成功。造模完成后小鼠随机分为肺癌模型组、扶正消积汤低、中、高剂量组及阳性对照组，10只/组，扶正消积汤低、中、高剂量组分别按照6.5、13、26 g/kg（以生药含量计）灌胃给予扶正消积汤，阳性对照组按照25 mg/kg灌胃环磷酰胺，肺癌模型组灌胃给予等量生理盐水，每日1次，连续28 d。

1.5 小鼠IgG、IgA、IgM水平的测定

小鼠使用戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，室温静置30 min，离心取上清，使用试剂盒测定IgG、IgA、IgM水平。

1.6 小鼠肿瘤体积及肿瘤抑制率的测定

颈椎脱臼法处死小鼠，分离肿瘤，分别测定瘤体长径（L）及短径（W），计算肿瘤体积及抑制率。肿瘤体积=（L×W²）/2。肿瘤抑制率=（肺癌模型组肿瘤体积-实验组肿瘤体积）/肺癌模型组肿瘤体积×100%。

1.7 小鼠CD4⁺、CD8⁺细胞比例及CD4⁺/CD8⁺值的测定

小鼠腹主动脉取血，加入红细胞裂解液，4℃孵育15 min，离心弃上清，使用磷酸盐缓冲液重悬细胞，分别使用FITC标记CD4⁺抗体及APC标记CD8⁺抗体4℃避光孵育30 min，使用流式细胞仪测定CD4⁺、CD8⁺细胞比例，并计算CD4⁺/CD8⁺值。

1.8 小鼠IL-4、INF-γ、IL-17A、Foxp3阳性细胞比例的测定

分离小鼠肠系膜淋巴结，置于磷酸盐缓冲液淹没并过200目滤网，离心，弃去上清，制备单个细胞悬液，使用APC-Cy7-CD3抗体及FITC-CD4抗体染色后，分别用小鼠PerCP/Cy5.5- INF-γ抗体、PE-IL-4抗体、APC- IL-17A抗体染色，肠系膜淋巴结单个细胞经FITC-CD4及APC-CD25染色后，经PE-Cy7-Foxp3染色，使用流式细胞仪分别测定IL-4、INF-γ、IL-17A、Foxp3阳性细胞比例。

1.9 小鼠肠道双歧杆菌、肠杆菌、乳酸杆菌及肠球菌菌落数的测定

小鼠颈椎脱臼处死后分离盲肠内容物，无菌环境中取0.1 g盲肠内容物，加入0.9 mL无菌生理盐水，混匀后，梯度稀释后，取0.1 mL细菌混悬液接种于培养皿，分别需氧培养24 h及厌氧培养48 h，计算双歧杆菌、肠杆菌、乳酸杆菌及肠球菌菌落数（CFU），结果以logCFU/g表示。

1.10 小鼠肺组织病理检查

小鼠颈椎脱臼处死，分离肺组织，使用石蜡包埋并切片，常规HE染色，置于光学显微镜观察。

1.11 小鼠肿瘤组织E-cadherin、vimentin、β-catenin蛋白的测定

小鼠颈椎脱臼处死，分离肿瘤组织，裂解匀浆并离心，分离上清，测定蛋白含量，设置上样量为40 μg，电泳分离并转移至聚偏氟乙烯膜，使用脱脂牛奶室温封闭1 h，分别经GAPDH、E-cadherin、vimentin、β-catenin兔抗体（1:500稀释）4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液清洗3次，山羊抗兔二抗（1:1 000稀释）室温孵育1 h，磷酸盐缓冲液再次清洗3次，使用凝胶成像仪拍照，以GAPDH为内参，计算E-cadherin、vimentin、β-catenin相对水平。

1.12 统计学方法

本实验所有数据使用SPSS 26.0软件分析处理，计数资料采用卡方检验，计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 扶正消积汤对Lewis肺癌小鼠IgG、IgA、IgM的影响

见表1。

2.2 扶正消积汤对Lewis肺癌小鼠肿瘤体积及肿瘤抑制率的影响

见表2。

2.3 扶正消积汤对Lewis肺癌小鼠CD4⁺、CD8⁺细胞比例及CD4⁺/CD8⁺的影响

见表3。

2.4 扶正消积汤对Lewis肺癌小鼠IL-4、INF-γ、IL-17A、Foxp3阳性细胞比例的影响

见表4。

2.5 扶正消积汤对Lewis肺癌小鼠肠道双歧杆菌、肠杆菌、乳酸杆菌及肠球菌菌群的影响

见表5。

2.6 扶正消积汤对Lewis肺癌小鼠肺组织病理的影响

如图1所示，肺癌模型组小鼠肺癌结节明显，肺组织细胞排列不整齐，与肺癌模型组比较，扶正消积汤各剂量组小鼠肺组织结节数明显减少。

2.7 扶正消积汤对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织E-cadherin、vimentin、β-catenin蛋白的影响

如图2。

3 讨论

肺癌是临床中常见的呼吸系统肿瘤，其发生及进展与吸烟、空气污染、职业暴露及遗传等因素密切相关。目前肺癌的治疗方法包括手术治疗、放射治疗及化疗，但上述治疗手段仍存在有效率低、不良反应大等缺点，所以肺癌治疗药物的研发仍是当前亟需解决的问题。

中医学理论认为，肺癌是以正气亏虚，邪气入侵，邪正相搏，正不制邪，加之七情失调，以致经络痞涩，聚结成核，肺之宣降失司。因此，中医理论认为，肺癌的治疗应以调理气机，扶正培本，补益虚损、益气养阴为主。扶正消积汤是以中医扶正祛邪、化瘀散结理论制的方剂，方中党参健脾益肺，养血生津，黄芪益卫固表，健脾补中，茯苓健脾益气，利水渗湿，白花蛇舌草散瘀消肿，清热解毒，薏苡仁健脾渗湿，仙鹤草收敛止血，白术补气健脾，燥湿利水，陈皮行气通痹止痛，炙甘草润肺止咳，缓急止痛，益气补中。全方共奏散瘀止痛，解毒利湿，健脾益气，养阴生津之功效。然而，扶正消积汤对肺癌的治疗作用及机制有待进一步明确，因此，本实验通过研究扶正消积汤对肺癌小鼠的肿瘤抑制作用，为扶正消积汤药理作用研究提供参考。

近年来研究证实，肠道免疫平衡对肺癌治疗效果及预后有重要作用，IgG、IgA、IgM水平与机体免疫功能及肺癌进展有关，福泉等^[7]研究证实，IgG、IgA、IgM水平降低与肺癌患者耐药有关；曾含梅等^[8]研究表明，升高肺癌患者血清IgG、IgA、IgM水平能够显著改善肺癌患者化疗预后，抑制肺癌进展；由此可见，调节IgG、IgA、IgM水平能够显著改善免疫功能并显著抑制肺癌进展。本实验结果表明，与肺癌模型组比较，扶正消积汤各剂量组显著升高IgG、IgA、IgM水平，提示扶正消积汤能够呈剂量依赖性显著改善肺癌小鼠免疫功能，进而抑制肺癌进展。

CD4⁺、CD8⁺细胞比例反映免疫功能状态，同时与肺癌转移及肿瘤增长密切相关。莫娟梅等^[9]研究证实，升高CD4⁺细胞比例，降低CD8⁺细胞比例能够通过显著升高小鼠免疫功能，抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤增长；李燕华等^[10]研究表明，升高CD4⁺细胞比例及CD4⁺/CD8⁺比值，能够显著通过抑制肿瘤微血管生成而抑制肿瘤增长。由此可见，调节CD4⁺、CD8⁺细胞比例可能是提高免疫功能，抑制肺癌进展的有效途径和方法。本实验结果证实，扶正消积汤能够显著升高CD4⁺细胞比例，降低CD8⁺细胞比例，提高CD4⁺/CD8⁺比值，提示扶正消积汤能够呈剂量依赖性显著升高肺癌小鼠CD4⁺细胞比例及CD4⁺/CD8⁺比值，进而改善Lewis肺癌小鼠免疫功能。

研究表明，免疫平衡在肺癌的发展及治疗中起重要作用，詹雪等^[11]研究证实，调节Th1/Th2平衡，能够显著抑制肺癌小鼠免疫逃逸，进而显著抑制肿瘤增长；蒋海燕等^[12]研究证实，调节肠道Th17/Treg平衡则能够显著调节肺癌小鼠免疫平衡，进而抑制肺癌转移及进展。由此可见，调节免疫平衡可能是治疗肺癌的有效途径及方法。本实验中以IL-4、INF-γ、IL-17A、Foxp3水平分别标记Th2、Th1、Th17、Treg细胞，本实验结果表明，与肺癌模型组比较，扶正消积汤各剂量组小鼠IL-4、Foxp3阳性细胞数显著降低，INF-γ、IL-17A则明显升高，提示扶正消积汤显著降低Th2细胞，同时升高Th1水平，抑制Th1细胞向Th2漂移。同时，扶正消积汤显著升高肺癌小鼠Th17细胞水平，降低Treg水平，提示扶正消积汤能够显著抑制肺癌小鼠肠道Th17细胞向Treg漂移。

双歧杆菌、肠杆菌、乳酸杆菌、肠球菌菌群是维持肠道正常环境的关键因素，其水平变化与肠道免疫功能的改善密切相关。张胤等^[13]研究证实，升高肺癌患者双歧杆菌、乳酸杆菌数量，同时降低肠球菌及大肠杆菌数量，进而调节肺癌患者肠道菌群平衡，改善患者免疫功能，提高肺癌患者化疗效果。由此可见，调节肠道菌群可能是提高免疫功能及肺癌治疗效果的有效途径。本实验结果表明，扶正消积汤能够呈剂量依赖性显著升高Lewis肺癌小鼠双歧杆菌及乳酸杆菌数量，降低肠杆菌及肠球菌菌落数，进而维持肺癌小鼠肠道菌群平衡，改善肠道免疫平衡，抑制肺癌小鼠肿瘤进展。

肿瘤微环境的形成是导致肺癌细胞增殖转移的关键因素，而E-cadherin、vimentin、β-catenin则是肿瘤微环境形成的标志蛋白。郭晓峰等^[14]临床研究证实，E-cadherin蛋白水平降低是导致非小细胞肺癌患者肿瘤转移的重要原因；殷玉等^[15]研究表明，vimentin水平升高同时E-cadherin水平降低是非小细胞肺癌细胞迁移及侵袭的关键因素；闫燕艳等^[16]研究表明，降低非小细胞肺癌细胞β-catenin并升高E-cadherin水平，能够显著抑制肺癌细胞增殖及迁移能力。由此可见，调节E-cadherin、vimentin、β-catenin水平可能是肺癌治疗的关键途径。本实验结果表明，扶正消积汤能够呈剂量依赖性显著升高E-cadherin水平，同时降低vimentin、β-catenin水平，进而调节肿瘤微环境的形成，抑制肺癌增长及侵袭。

综上所述，扶正消积汤能够调控Lewis肺癌小鼠肠道免疫平衡，进而显著抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及转移，调节肿瘤微环境，改善小鼠免疫功能及肠道菌群，进而显著抑制小鼠肺癌进展。

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基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2023D01A92)