靶向TRPV1/A1通道多肽的分子作用机制

Molecular mechanism of action of polypeptides targeting TRPV1/A1 channels

摘要

瞬时受体电位（transient receptor potential， TRP）通道超家族包括多种阳离子通道，参与嗅觉、味觉、疼痛、温度感知等多种生理病理过程。多肽药物因其高特异性和低毒性等诸多优点，在调节离子通道方面显示出巨大潜力。文章聚焦TRPV1和TRPA1通道探讨其分子特征与在痛觉和瘙痒中的作用，分析了靶向TRPV1和TRPA1的毒素多肽的作用机制，增进对通道调控机制的理解，以期为新型TRP通道亚型特异性人工肽的设计和研制提供新思路。

Abstract

The transient receptor potential （TRP） channel superfamily includes a variety of cation channels， which are involved in various physiological and pathological processes such as smell， taste， pain， and temperature perception. Polypeptide drugs have shown great potential in regulating ion channels because of their many advantages such as high specificity and low toxicity. This paper focuses on TRPV1 and TRPA1 channels to explore their molecular characteristics and role in pain and itch， and analyzes the mechanisms of action of toxin polypeptides targeting TRPV1 and TRPA1 to enhance the understanding of channel regulatory mechanisms， with the aim of providing new ideas for the design and development of novel TRP channel subtype-specific artificial peptides.

Graphical abstract

关键词

TRP通道 / 多肽 / 药物 / 分子调节机制

Key words

TRP channels / peptides / drugs / molecular regulatory mechanisms

瞬时受体电位（transient receptor potential， TRP）通道是一类非选择性阳离子通道，广泛分布于哺乳动物的多种细胞中，参与嗅觉、味觉、疼痛、痒觉、温度感知等多种生理病理过程^［1］。TRP通道的异常活动与慢性疼痛、炎症性疾病和某些遗传性疾病等相关。例如TRPA1抑制剂HC-030031在神经病理性疼痛模型中表现出显著的机械超敏逆转效应，而TRPV1拮抗剂SB705498在偏头痛治疗中显示出临床潜力^［2］。值得注意的是，该家族成员的功能冗余与组织分布特异性之间的动态平衡机制仍存在重要知识缺口，因此，对TRP通道的结构、功能及其调控机制的深入理解，对于发展新型治疗策略具有重大意义。

多肽药物是指通过生物合成法或者化学合成法获得的具有特定治疗作用的多肽，广泛应用于各种医疗领域，具有独特的高特异性和低毒性特点^［3］，在调节离子通道功能方面展现出巨大的应用前景。特别是源自天然毒液的毒素多肽，其对离子通道的高亲和力，让毒素多肽成为研究TRP通道功能的重要工具。对于某些重要的药物靶点，可能是首选治疗途径。TRPV1和TRPA1通道因其在痛觉和瘙痒感知中的重要作用而备受关注，首个TRPV1靶向肽类药物Resiniferatoxin（RTX）已进入Ⅲ期临床，其通过不可逆激活实现伤害性神经元消融，为顽固性疼痛治疗提供全新策略^［4］。2023年FDA批准的斑蝎毒素衍生肽TzP-1开创了TRPA1亚型特异性调控新纪元，其通过变构结合界面实现通道门控的精准调控。

本文系统整合结构生物学与药理学研究进展，通过探讨TRPV1和TRPA1通道的分子特征、生理功能以及它们在疾病中的作用，解析毒素多肽的分子结合特征与门控调控规律，提出基于构象选择的亚型特异性设计策略，旨在增进对TRP通道调控机制的新理解，突破同源选择性瓶颈，为新型TRP通道亚型特异性人工肽设计提供新思路，推动疼痛管理和感觉信号传递领域的发展。

1 TRP通道的结构和功能

哺乳动物的TRP通道有7个家族，包括TRPC（canonical）、TRPV（vanilloid）、TRPM（melastatin）、TRPA（ankyrin）、TRPP（polycystin）、TRPML（mucolipin）和TRPN（DrosophilaNOMPC）^［1］。所有TRP通道都由4个亚基组成，每个亚基包括6个跨膜结构域（S1-S6），S1-S4跨膜片段，形成外周感知域，而S5和S6四聚体形成中心孔。TRP通道在感觉神经元、皮肤和大脑中广泛表达^［5］，参与温度、机械与化学刺激的感知。游离神经末梢或感觉神经元感觉小体中的多个TRP通道将痛觉的热刺激（TRPV1、TRPA1、TRPM8和TRPM3）、化学刺激（TRPA1）和机械刺激（TRPC1、TRPC3、TRPC6、TRPA1、TRPV2和TRPV4）转化为电生理兴奋。瘙痒和疼痛的感觉是由外周神经元的敏化和激活引起的，其远端过程起源于初级传入背根神经节的细胞体^［5］。TRPA1与TRPV家族广泛参与痛痒觉的调控。TRP通道的打开导致神经元膜的去极化和痛觉信号的处理，产生瘙痒感觉。瘙痒通过组胺能和非组胺能途径介导，这两种途径都需要TRP信号传导^［5］。TRPA1在神经性疼痛、炎症性疼痛和遗传性发作性疼痛综合征等多种疼痛中发挥作用。TRPV1是一种由炎症介质调节的热激活阳离子通道，参与急性和慢性疼痛。TRPV家族和TRPA1在炎症、疼痛和瘙痒信号的传播中起关键作用^［6］。

2 多肽靶向TRP通道的分子机制

2.1 多肽类离子通道调制剂

多肽类药物（500~5 000 Da）在药物开发中占据独特的桥梁地位，相较于小分子药物（<500 Da），其通过柔性构象可靶向传统难成药的靶点（如离子通道胞外门控区、GPCR跨膜界面），而相较于大分子蛋白药物（>5 000 Da），其保留化学合成优势的同时具备更强的组织渗透性。部分多肽可通过受体介导的转胞吞作用穿透血脑屏障（如Angiopep-2结合LRP1受体），而小分子依赖被动扩散易受P-糖蛋白外排影响，导致中枢递送效率低下^［7］。尽管多肽与小分子均依赖化学合成技术，但其优化策略存在差异，小分子药物主要通过结构简化提升代谢稳定性，而多肽常通过引入非天然氨基酸（如D型氨基酸）、环化修饰或脂质化增强蛋白酶抗性及递送能力。例如，二环肽Cyclo ［His-Pro］经静脉注射后可通过缓慢扩散穿透血脑屏障，其颅内效力较外周给药提升200倍，这一特性在小分子药物中极为罕见^［8］。多肽药物目前广泛应用于疫苗、抗肿瘤、抗菌、内分泌、心血管等医疗领域，具有副作用小、特异性强、效果显著等诸多优点。多肽分子对靶受体具有高效力和高选择性，使其在调节离子通道功能方面展现出巨大的应用前景^［9］。

狼蛛毒液中存在含有抑制性半胱氨酸结（Inhibitor Cystine Knot，ICK）基序的蜘蛛蛋白，其可以选择性激活TRPV1通道。从北方短尾鼩的麻痹毒液中发现的肽SORC3，被认为可直接与TRPV6相互作用^［10］。海葵毒液中存在着大量富含二硫键的多肽分子，这些多肽分子是多种离子通道的抑制剂和调节剂。蝎毒是由蝎尾节末端腺体分泌的一种以多肽为主、具有较强神经毒性的混合物，它可以阻断或改变细胞中离子通道的状态进而影响细胞兴奋性^［11］。防御素多肽是一类阳离子抗菌肽，广泛存在于自然界各种物种中，包括真菌、植物、动物。这类多肽一般是由小于100个氨基酸组成，防御素多肽与蝎毒多肽，序列构成以及空间结构上都具有相似性，表明二者在进化上存在一定的关系^［11］。从中国红头蜈蚣中发现的一种新的靶向TRPV1肽毒素，被命名为RhTx。目前，许多毒液的毒素多肽已被鉴定和合成。由于毒素多肽对离子通道的高亲和力，多肽开发的多肽药物广泛应用于各种离子通道，让毒素多肽成为研究离子通道功能的重要工具，具有显著的药物开发潜力。

2.2 多肽靶向TRPV1通道的分子结合机制

TRPV通道是TRP通道超家族的一部分，可被植物中的香兰素、香草酸和辣椒素激活，TRPV1被称为感知损伤信号的痛觉受体，在神经性疼痛和慢性疼痛中，TRPV1起核心作用。TRPV1可分为外孔区；孔隙螺旋；选择性过滤区；中央腔和内孔区。外孔区对应于与膜的细胞外侧接触的部分，与多种毒素多肽的结合有关^［12］。TRPV1是一种同质四聚体，每个同质亚基由6个细胞内跨膜核区（S1-6）组成（图1），在S5和S6之间有疏水拉伸孔域^［13］。S1-4包含一个电压传感器、一个N端锚蛋白重复序列、一个连接子、一个预S1连接子和一个激动剂的结合位点。在S4和S5之间有一个连接区域，在通道域之间的变构耦合中起重要作用^［14］，并将S1-4的构象变化转化为孔门控。TRPV1具有四重对称性，配体结合结构具有不同的孔轮廓，并且在膜双层深处有一个香草蛋白结合袋，是S3、S4、S4-S5连接体和S6形成的疏水区域。由革兰氏阴性细菌病原体产生的毒素重复序列（RTX）通过氢键与S3中的酪氨酸结合，并通过与S3、S4、S4-S5连接体和S6相邻亚基中的几个氨基酸的疏水相互作用而稳定^［12］。

双结毒素DkTx由75个氨基酸组成，这种多肽具有独特的二价结构，表现出新的序列特征：两个ICK基元，称为knot1（K1）和knot2（K2）结构域^［10］，由一个连接体连接。DkTx是已知的第一个在一个分子内含有两个ICK基元的毒素多肽^［15］。DkTx的两个ICK基元分别结合四聚体通道相邻亚基中的两个同源结合位点，其连接体采用紧绷和约束构象。每个ICK结构域包含6个半胱氨酸残基，形成硫化物桥^［14］。DkTx以相对高的亲和力和缓慢的解离动力学直接结合到外孔域，从而激活TRPV1通道^［16］。两种香草质激动剂，RTX和辣椒素结合在香草质口袋中，DkTx使TRPV1与RTX结合后通道保持开放状态^［17］。TRPV1与DkTx/RTX配合物结合，DkTx分子位于TRPV1外孔区顶部。ICK基序的每个疏水区穿过脂质双分子层，插入相邻亚基和S6细胞外侧之间的缝隙^［18］。DkTx通过其4个残基与S5和S6孔螺旋环相互作用，可与TRPV1的外孔区形成稳定的非共价配合物^［14-15］。它以开放的状态结合到TRPV1外部孔的外边缘，将疏水残基插入双层中。DkTx的IKS也与膜双分子层中的脂质相互作用，形成多肽-通道-脂质三方复合物。该多肽的抗体样结构使其能够与TRPV1形成稳定的结合，并将通道锁定在开放状态^［10］。高度稳定的DkTx-TRPV1复合物的形成可以产生最大的电流振幅，导致与蜘蛛咬伤相关的衰弱和持续的疼痛反应^［15］。

香草毒素VaTxs是从狼蛛的毒液中分离出来的含ICK基序肽。VaTxs由四种蜘蛛毒素多肽组成，通过与通道外孔区域相互作用激活TRPV1，其中三种多肽（VaTx1，VaTx2和VaTx3）可引起TRPV1的可逆激活。VaTxs作为TRPV1激动剂，通过结合通道的细胞外孔域，打开通道，触发阳离子的涌入，引发痛觉过敏^［10］。VaTx1和VaTx2也作为Kv2型电压栅K⁺通道（Kv2）的拮抗剂^［22］，导致瘫痪和高兴奋性。尽管TRPV1和Kv2结构相似，但VaTx1-2结合到Kv2的电压感应域而不是孔域^［10］。

RhTx是一种含有27个氨基酸的多肽，存在于残肢蜈蚣（Scolopendromorpha）毒液中。RhTx有两对二硫键，四个带电荷残基和一个极性残基参与RhTx-TRPV1的结合^［4］。RhTx的结构分析显示，分子的一侧有两个二硫键和一簇带电残基，使多肽具有极性。来自同一结构域的天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸残基和一个精氨酸残基分别参与了RhTx-TRPV1的结合，导致TRPV1激活减少或增强。多肽的带电表面与通道形成静电相互作用。经过分析通道与RhTx的相互作用，TRPV1孔螺旋的天冬氨酸、酪氨酸和苏氨酸是该多肽激活TRPV1的关键^［19］。RhTx的N端不含带电氨基酸，而肽的C端富含带电氨基酸。RhTx可以利用电场力和疏水力与通道的孔区转角结构和螺旋结构进行直接的相互作用，并且通过影响TRPV1的热激活门来调控通道^［20］。RhTx对TRPV1的激活高度依赖温度，温度升高会强烈增强多肽的活性^［22］。因此，RhTx在生理体温下是一种有效的TRPV1激活剂，引起强烈的灼痛感^［21］。

BmP01是从马氏钳蝎（ButhusmartensiiKarsch）毒液中分离出的一种含29个氨基酸的短肽，通过三对二硫键交联短的α螺旋和两条β链形成紧凑的结构^［22］，其具有典型的ICK基元结构。这种多肽具有双重功能，它既激活TRPV1又抑制Kv通道，从而导致过度兴奋的伤害感受状态。BmP01结合到TRPV1的外孔结构域，该结构域包含位于孔螺旋S6环的三个极性残基，它们影响TRPV1的门控，故而诱导疼痛信号^［14］。TRPV1有两个激活位点，S6螺旋交叉处和选择性滤波器处。通过与外孔的相互作用，BmP01可以直接影响上孔的开闭平衡。TRPV1外孔区的谷氨酸残基在酸性条件下发生质子化，使TRPV1增敏，导致BmP01对TRPV1的激动作用增强^［19］。BmP01既能结合在外孔区，又能结合到turret中氢质子的结合位点，因此，BmP01和质子使用“分子组合拳”的机制协同作用于TRPV1通道。BmP01属于α-KTX8多肽亚家族，这个家族中K23区域是高度保守的，对BmP01-TRPV1相互作用至关重要^［22］。此区域与TRPV1孔螺旋结合打开通道。

APHC1-3是从热带海葵（Heteractiscrispa）中提取的56个氨基酸的多肽，这些肽属于Kunitz型胰蛋白酶抑制剂，具有缓慢的丝氨酸蛋白酶抑制活性。多肽与TRPV1相互作用的残基位于外孔结构域，涉及孔螺旋和两个细胞外环，并与质子结合位点重叠。多肽与TRPV1外孔域相互作用。APHC1与两个TRPV1亚基同时相互作用^［23］。多肽C末端的精氨酸残基介导多肽与TRPV1外孔结构域之间的相互作用。此外，多肽的两种构象状态依赖于打开或关闭的TRPV1通道，这表明存在影响多肽的通道和影响通道的多肽的构象重排的双向效应^［19］。它与TRPV1外环结合，在低浓度辣椒素下可增强TRPV1反应，但在高浓度辣椒素下可阻断该反应。APHCs与参与质子激活的外环结构域结合。这可以直接影响TRPV1上部闸门的打开，因为结合位点影响质子结合条件，并且可以与APHC或辣椒素结合位点变构偶联^［14］。

2.3 多肽靶向TRPA1通道的分子结合机制

TRPA1是一种非选择性阳离子通道，表达于背根神经节、三叉神经和结节性感觉神经节的伤害性感觉神经元中，作为几种有害物理和化学刺激的细胞传感器。TRPA1具有一个细长的锚蛋白重复结构域，其作用是控制蛋白质-蛋白质相互作用，以及质膜中的通道插入和调节^［24］。在TRPA1的三维结构中，TRP结构域与富含半胱氨酸的N端连接域相互作用，这种相互作用是变构联系的基础，与亲电激动剂对TRPA1的激活有关^［25］。该蛋白末端的初始区域位于第一个跨膜片段之前，负责TRPA1的变构调节，由一个突出的锚蛋白重复结构域和一个连接体组成（图2），由一个β-发夹环和两个α-螺旋和前S1螺旋组成，将锚蛋白重复序列连接到第一个跨膜片段^［24］。在这个锚蛋白重复结构域附近是使TRPA1能够被亲电化合物激活的残基^［4］，亲电化合物包括广泛的内源性和外源性反应性化学物质和刺激物，因此，TRPA1作为有害化学传感器起关键作用^［24］。

WaTx是在澳大利亚黑岩蝎（Urodacusmanicatus）中发现的一种32个氨基酸的多肽，含有一个典型的ICK基序，具有两个二硫桥^［25］。WaTx穿透质膜，通过双分子层完全易位进入TRPA1的细胞质结合位点，激活TRPA1诱导急性疼痛和疼痛超敏反应。与经典TRPA1激动剂相比，WaTx是一个相对较大的大分子，没有明显的亲电性。它是一个由两个二硫键稳定构成的刚性和紧凑的螺旋发夹折叠。WaTx在发夹的开放端形成一个特殊序列，氨基末端螺旋表现出异常密集的偶极矩。这个特征共同构成细胞穿透基序^［29］。将基本斑块中赖氨酸，谷氨酰胺，精氨酸残基分别用丙氨酸取代，其中，只有赖氨酸在细胞连接模式下显示出激活通道的能力降低，故赖氨酸应该是WaTx作用于通道的位点。WaTx主要通过产生细胞质第二信使或穿过膜进入TRPA1来介导其作用^［26］。TRPA1中富含半胱氨酸的连接区域是多肽结合的位置。由于WaTx可以激活哺乳动物的TRPA1直系同源物，而来自更远亲物种的通道（如蛇、鱼、苍蝇和蠕虫）没有作用。研究发现，使用人和大鼠-蛇TRPA1（分别为hTRPA1和rsTRPA1）作为供体-受体对，将C-末端TRP结构域从rsTRPA1转移到hTRPA1，嵌合体产生了对WaTx不敏感但被AITC稳健激活的通道，可以确定该结构域是毒素敏感性的关键因素^［25］。然而，反向嵌合体（含有hTRPA1结构域的rsTRPA1）保持毒素不敏感，表明该区域是必需的，但不足以赋予WaTx敏感性。在TRPA1的三维结构中，TRP结构域与N-末端富含半胱氨酸的接头结构域进行广泛的相互作用，这种相互作用形成了对于亲电激动剂的激活至关重要的“变构联系”的核心。研究发现从hTRPA1到rsTRPA1通道的富含半胱氨酸的连接区的转移足以赋予毒素敏感性。在富含半胱氨酸的接头内，hTRPA1的三个氨基酸的转化（脯氨酸变为丙氨酸、甲硫氨酸变为亮氨酸和苏氨酸变为脯氨酸）与同源rsTRPA1残基的结合消除了毒素敏感性，在相反的变化中，只有第一个变化（丙氨酸变为脯氨酸）是足以赋予大鼠蛇通道毒素敏感性，表明该位置的脯氨酸是WaTx物种选择性的关键决定因素^［25］。WaTx与TRPA1的结合，是与此区域之间形成的整合复合物相互作用。这些区域紧密相连，形成了多肽可以嵌套的潜在结合袋，WaTx作用于结构集成的变构连接，也将亲电反应性传导到通道门。WaTx诱发反应的一个显著特征是TRPA1对Ca²⁺离子的渗透性大大降低。

多肽毒素t-ProTx-I是在秘鲁绿天鹅绒狼蛛（Thrixopelmapruriens）毒液的35个残基肽的基础上构建的，原多肽可以阻断几种不同的电压门控离子通道。而t-ProTx-I通过结合通道的S1-S4门控域来抑制Nav和TRPA1。t-ProTx-I中由色氨酸、缬氨酸侧链组成的疏水残基与被激活的TRPA1的S1-S4门控结构域结合抑制Ca²⁺内流^［10］。改变t-ProTx-I内部19位的亮氨酸会降低对通道的抑制活性，这表明亮氨酸突变破坏了ProTx-I的折叠。但是t-ProTx-I抑制TRPA1的机制与电压门控通道相同，两个结合表面之间共有三个残基：丝氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，这三个残基在两个结合载体上共享，都是与S1-S4门控域的封闭构象的缓慢解离和稳定相关^［27］。

Ms9a-1是从老年分枝杆菌毒液中分离出的一种多肽，可增强TRPA1对炎症性疼痛的激活。Ms9a-1具有9a族海葵毒素多肽的无边界发夹肽折叠特征。该族的所有肽均编码为复杂多肽前体的一部分。在Ms9a-1中，研究者发现了两种前体，每种前体由信号肽、间隔区、活性肽Ms9a-1和另一种肽Ms9a-2或Ms9a-3组成。Ms9a-1与同源多肽明显不同，其扩展C末端可能是由于二肽基肽酶加工位点（DP或EP）的突变而出现的^［28］。这种突变可能是TRPA1增强活性出现的原因。

最近研究发现，从巴西武装蜘蛛（Phoneutrianigriventer）的毒液中分离出Phα1β（PnTx3-6），它是由55个氨基酸组成的多肽。其含有ICK基序，含有6个二硫键，Phα1β在其表面具有较大的疏水区，是TRPA1的拮抗剂^［29］。影响“P-loop”超家族通道门控的蜘蛛毒素多肽（包括电压门控的Na⁺、K⁺和Ca²⁺通道以及TRP通道）通常靶向S1-S4门控域。这些结构域嵌入膜中，通常具有短的细胞外环。一些蜘蛛毒素多肽从膜表面与S1-S4结构域结合。Phα1β不会物理阻塞TRPA1的离子传导孔，它是一种门控修饰多肽，带正电，通过静电相互作用与脂质双分子层结合，具有膜亲和性，与S1-S4结构域的外界面相互作用^［29］。

3 总结与展望

TRP通道超家族由阳离子渗透通道组成，在感觉信号传导中发挥重要作用，其通过多种机制被激活引发系列反应，参与嗅觉、味觉、疼痛、温度和信息素等的感知。靶向疼痛相关离子通道的天然多肽具有较好的亚型选择性与安全性，是开发疼痛治疗药物的天然宝库^［30］。本文中对于TRPV1和TRPA1通道结合的毒素多肽，大多数都属于疏水性氨基酸、碱性氨基酸，其中只有RhTx里包含酸性氨基酸。这些多肽中，只有两种多肽对通道产生抑制效果，分别是APHC在高浓度下抑制TRPV1，t-ProTx-I通过结合TRPA1的S1-S4门控域抑制该通道，其他多肽通过与相关通道的S4-S6激活相关通道，提示TRPV1和TRPA1的S4-S6区域可能与激活有关，S1-S4可能与抑制有关。TRPV1中的苏氨酸、酪氨酸和天冬氨酸可能是激活的关键氨基酸。APHC对TRPV1具有双功能，低浓度下激活TRPV1，高浓度下抑制TRPV1，其中机制有待深入研究。APHC和t-ProTx-I这两种多肽中都含有缬氨酸残基作用于通道，推测缬氨酸可能在其中参与一定作用，还需进一步实验验证。与通道结合的氨基酸中，有大量的疏水氨基酸和极性氨基酸，故大多数多肽都以静电和疏水作用与通道结合。多肽中ICK基元是一个标志的结构域，该基元普遍参与多肽-通道相互作用。

不同多肽的物种选择性也会影响药物的研发。例如WaTx的结合依赖于特定位置的脯氨酸残基。人类的脯氨酸残基对WaTx的结合至关重要，而某些啮齿类动物（如小鼠）的同源位点可能因序列差异导致结合能力下降，从而导致药物在啮齿类动物中的安全性可能无法预测人体毒性。μ-芋螺毒素是疾病相关的NaV通道的有效抑制剂，但许多μ-芋螺毒素在hNaV1.7处明显缺乏抑制效力，只有少数研究分析了它们的作用。例如两种µ-芋螺毒素：SmIIIA和SxIIIC，它们在不同物种间表现出不同的抑制效力^［31］。SmIIIA比SxIIIC更有效地抑制hNaV1.7。这些毒素在不同亚型中的混杂活性阻碍了它们的治疗开发潜力。多肽的物种选择性需要靶向性优化工具，设计特异性人工肽，使得人工肽可以精准调控。

动物毒素多肽作为一种具有独特的高特异性和低毒性特点的多肽药物，但目前对其的广泛开发尚不完善；尽管对动物毒液中存在的有限数量的二硫化物结构有广泛的了解，但许多富含二硫化物的毒液肽家族尚未被探索。本文期望通过综述TRPV1和TRPA1与毒素多肽作用机制与分子特征，为TRPV1/A1通道靶向调节剂的开发提供一些新思路。

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基金资助

陕西省教育厅项目(22JC060)

陕西省重点研发计划项目(2023-YBSF-543)

陕西省重点研发计划项目(2024NC-YBXM-172)

延安大学科研项目(2023KXJ-001)

延安大学科研项目(2023JBZR-004)