基于形态学、拮抗试验、ITS序列与ISSR标记的21个滑子菇菌株遗传多样性分析

Genetic diversity analysis of 21 Pholiota nameko strains based on morphology， antagonism test， ITS sequence and ISSR labeling

摘要

滑子菇（Pholiota nameko）作为一种珍贵的食用菌，具有显著的食药用价值，但市面上的许多滑子菇品种存在同物异名、同名异物现象，严重阻碍滑子菇产业前进的脚步。本研究以21个滑子菇菌株为研究对象，通过形态学观察、拮抗试验、ITS序列分析和ISSR分子标记技术进行种质资源鉴定与遗传多样性分析。滑子菇菌株拮抗结果分为隆起型、沟壑型、线型和无拮抗4种类型，多数具有拮抗反应。采用6个筛选出的ISSR引物对供试菌株进行PCR扩增，共获得59条清晰条带，其中多态性条带53条，多态性比率为89.83%。基于ISSR标记数据的UPMGA聚类分析显示，在相似系数0.42水平上，21个菌株可分为4个明显类群；菌株间遗传相似系数介于0.19~0.91之间。研究结果表明：1）供试滑子菇菌株具有丰富的遗传多样性；2）ISSR分子标记技术可有效区分不同菌株并揭示其亲缘关系；3）本研究为滑子菇种质资源鉴定和遗传育种提供理论依据。

Abstract

As a precious edible fungus， Pholiota nameko has significant edible and medicinal value. However， many varieties of Pholiota nameko on the market have the phenomenon of synonyms and homonyms， which seriously hinders the progress of the Pholiota nameko industry.In this study， 21 strains of Pholiota nameko were used as the research object， and the germplasm resources identification and genetic diversity analysis were carried out by morphological observation， antagonistic test， ITS sequence analysis and ISSR molecular marker technology. The antagonistic results were divided into four types ： uplift type， gully type， linear type and non-antagonistic type， most of which had antagonistic reactions.Six selected ISSR primers were used for PCR amplification with the DNA of the 21 Pholiota nameko strains as templates， resulting in a total of 59 clear bands， of which 53 were polymorphic， accounting for 89.83%. UPMGA cluster analysis of the obtained bands showed that， at a similarity coefficient of 0.42， the 21 Pholiota nameko strains could be divided into four major categories， clarifying the genetic relationships among the strains. The similarity among the 21 Pholiota nameko strains ranged from 0.19 to 0.91. These results indicate that the 21 Pholiota nameko strains possess rich genetic information， demonstrating genetic diversity among them.The findings indicate that： 1） The tested Pholiota nameko strains exhibit rich genetic diversity； 2） ISSR molecular marker technology can effectively differentiate distinct strains and reveal their genetic relationships； 3） This study provides a theoretical foundation for germplasm resource identification and genetic breeding of Pholiota nameko.

Graphical abstract

关键词

滑子菇 / 拮抗 / ISSR / 遗传多样性

Key words

Pholiota nameko / antagonism test / ISSR / genetic diversity

滑子菇（Pholiota nameko （T. Itô）S. Ito & S. Imai）是一种具备重要经济价值的食用菌，含有蛋白质、维生素、矿物质等营养成分，有抗氧化、降血脂以及抗炎等功能^{［1 - 6］}。然而，当下滑子菇产业面临严峻种质资源混乱状况，市面上流通菌株有同物异名、同名异物情况，极大影响产业健康发展以及育种工作开展。

食用菌种质资源遗传分析是评定遗传多样度、指引品种改良以及亲缘关系探究的关键，传统形态学鉴定法易受环境因素作用，分子生物学测定受限于数据库准确性，单一技术方式无法满足准确鉴定的需求。ISSR（简单序列间重复）分子标记有多态性高、重现性好、成本低等优势，结合ITS序列分析和拮抗试验，能构建更可靠的种质资源鉴定体系。

精准的种质资源鉴定是滑子菇育种工作的根基，本研究用形态学观察、拮抗试验、ITS序列分析以及ISSR分子标记等方法，对21个滑子菇菌株做种质资源鉴定以及遗传多样性分析，为滑子菇种质资源管理以及遗传育种提供科学依据。

1 实验材料

21个滑子菇供试菌株分别来源于贵州安顺、河北平泉、陕西延安菌舰生物科技有限公司，由延安大学生命科学学院食用菌科研实验室进行菌种保存，实验编号P1-P21（见表1）。

2 实验方法

2.1 供试培养基制备

PDA培养基和PDA综合培养基按照已发表文献进行制备^［7-8］。

2.2 菌丝活化及形态学观察

1）菌丝活化：无菌条件下分别将21个供试菌株接种在PDA固体培养基中央，23 ℃恒温黑暗培养约15 d，使菌丝恢复活力。

2）形态学观察：无菌条件下从活化后的菌种上取大小相同的1 cm菌块接种到新的PDA固体培养基中央23 ℃黑暗培养，每个菌株3个生物学重复，观察并记录菌丝浓密程度、菌丝颜色、边缘形态及生长速度指标。采用“十字”交叉法测量菌落直径。

菌丝日均生长速度（mm/d）=菌落生长直径（mm）/培养天数（d）^［9］。

2.3 拮抗试验

用打孔器取21个菌株活化后的菌落边缘菌丝接种到PDA平板上两两对峙，接种间距2 cm左右^［10］，共计231个组合，每种组合3个重复，于23 ℃暗培养，观察接种块交界处是否有拮抗现象。

2.4 ITS实验

在PDA培养基表面覆盖无菌玻璃纸，把活化后的菌块接种到玻璃纸中央，在23 ℃的恒温黑暗条件下培养16 d直到菌丝铺满平板，在无菌的条件下刮取0.2 g的新鲜菌丝放置到无菌的离心管当中，采用CTAB方法^［11］提取菌株基因组DNA，在-20 ℃保存备用。

PCR扩增反应的总体积是20 μL，体系的组成情况如下：2×SanTaq PCR Mix为10 μL，模板DNA（其浓度是20 ng/μL）为1 μL，上游引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）为1 μL，下游引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）为1 μL，ddH₂O为7 μL。

PCR反应的程序^［12］：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍照记录。验证合格的扩增产物送生工生物公司进行双向测序，获得高质量序列。

使用NCBI BLAST工具对测序的序列进行同源性的比对，比对的参数设置为序列覆盖度大于或者等于97%、序列相似度大于或者等于98%作为物种鉴定的核心阈值。采用MEGA 11.0软件，基于邻接法（Neighbor-Joining， NJ）来构建系统发育树，设置bootstrap检验为1 000次重复，以此来评估系统发育树的可靠性。

2.5 ISSR实验

本实验用生工生物工程（上海）股份有限公司合成的引物，从100条ISSR引物里随机挑30条做实验，具体引物及其序列见表2，运用ISSR-PCR扩增反应跟程序，先用菌株P1和P2的DNA做模板来筛选30条引物，接着做电泳检测并用凝胶成像系统拍照，留下扩增条带数多、重复性不错、强度高且清晰能辨的谱带对应的引物当作目标引物。再拿筛选出的引物对21个菌株DNA做PCR扩增，一样做电泳检测，并借凝胶成像仪拍照记下，利用“0/1”表型数据矩阵（相同片段位置有条带记作1，处理数据信息（无条带记成0），用NTSYS软件给样本做非加权配对算术平均法即UPMGA聚类分析来生成聚类图，依据聚类图分析滑子菇菌株间的遗传多样性。

2.6 数据统计分析

所有实验均设置3个生物学重复。数据采用SPSS 26.0软件进行方差分析，显著性水平设定为P<0.05。ISSR聚类分析采用NTSYS-PC 2.1软件，采用UPGMA法构建聚类图。

3 实验结果

3.1 滑子菇菌株菌丝培养特征

对滑子菇菌丝浓密程度、颜色、边缘形态及生长速度等指标进行观察与统计，结果显示，菌株日均生长速率范围在5.56~10.11 mm/d，多数菌株的日均生长速率在8.00 mm/d左右。P2、P6、P16、P20菌落边缘为絮状，P17、P18菌落边缘为锯齿状，生长速率整体较慢；其他菌株边缘都较整齐，菌株的日均生长速率在8 mm/d左右，菌丝浓密度等整体较浓密（如表3所示）。这在生产方面说明菌丝长势整齐平滑的菌株可能更利于生产，缩短培养周期。

3.2 滑子菇菌株拮抗实验

本研究对21个滑子菇菌株的菌丝两两之间进行拮抗实验^［13］，用于种质资源的初步鉴定。拮抗结果大致可以分为隆起型、沟壑型、线型和无拮抗型4种类型，231个组合中，208个组合出现拮抗反应（90.04%），23个组合未出现拮抗反应（9.96%）（如表4和图1所示）。其中线型反应170个组合（73.59%），沟壑型反应17个组合（7.36%），隆起型反应21个组合（9.09%）。

3.3 滑子菇菌株ITS实验

3.3.1 滑子菇DNA提取，扩增结果

使用CTAB法分别提取样本的DNA，经过PCR扩增后进行电泳并拍照记录，结果显示：扩增的片段在750 bp左右，没有杂带（如图2所示），符合测序要求。

3.3.2 滑子菇系统发育分析

通过上传测序序列至NCBI进行比对分析，采用MEGA 11.0构建系统发育树^［14］，结果如图3（红色标记为实验菌株）所示。ITS分析将21个菌株分为3个种类，具体分类如下：小孢鳞伞种：P1、P17、P20（3个菌株，占14.3%）；光帽鳞伞种：P3、P4、P5、P7、P8、P9、P10、P12、P14、P16、P18、P19、P21（13个菌株，占61.9%）；柠檬鳞伞种：P2、P6、P11、P13、P15（5个菌株，占23.8%）。

3.4 滑子菇菌株ISSR标记

3.4.1 引物筛选结果

从30条引物中共筛选出6条适合本次研究的反应引物，分别是ISSR807、ISSR808、ISSR809、ISSR826、ISSR827、ISSR830（如图4所示）。

3.4.2 ISSR引物扩增结果

6条筛选引物对21个供试菌株共扩增出59条清晰可辨的DNA条带，片段长度范围为100~2 000 bp（图5）。各引物扩增条带数为6~14条，平均每条引物扩增10条条带；其中多态性条带共53条，总多态性比率达89.83%，表明供试滑子菇菌株间具有丰富的遗传多样性。各引物的扩增结果统计详见表5。

不同引物的扩增效果存在明显差异：ISSR826和ISSR827引物扩增条带数量多且清晰度高，分别扩增出12条和14条清晰条带；ISSR830引物在部分菌株中扩增效果相对较弱；ISSR807、ISSR808、ISSR809引物扩增条带分布均匀，片段大小范围广。21个菌株在相同引物扩增下呈现出不同的条带模式，如P1-P5菌株在ISSR826引物下呈现出明显不同的条带分布，直观体现菌株间的遗传差异。

3.4.3 基于ISSR分子标记的聚类分析

使用NTSYS-PC软件进行聚类分析^［15］，构建21个菌株的亲缘关系树状图（如图6所示），相似性在0.19~0.91之间。结果显示相似系数为0.42时，将滑子菇菌株划分为四大类，第Ⅰ类包含菌株P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P21；第Ⅱ类包含菌株P11、P12、P13、P14、P15、P16，它们为早熟品种，菌丝长速快；第Ⅲ类包含菌株P18、P19、P20，具有出菇快，菇柄短，开伞早等特征；第Ⅳ类包含菌株P10、P17，它们均产量高，属于丛生、高柄，符合形态学特征。

4 讨论与结论

4.1 讨论

本项研究综合地采用形态学方面的观察、拮抗方面的试验、ITS序列的分析以及ISSR分子标记的技术，针对21个来自不同地方的滑子菇菌株开展系统的种质鉴定以及遗传多样性的分析工作，证实供试的这些菌株具有十分丰富的遗传多样性情况，所建立起来的多技术联合鉴定的体系能够有效地对滑子菇不同的物种以及菌株加以区分，为滑子菇种质资源的管理以及遗传育种提供科学的依据。其中，菌丝形态呈现整齐平滑状态的菌株，其生长的速率会更快一些，在实际的生产过程当中能够有效地缩短菌种培养的周期，具备着更高的栽培应用的潜力。

4.1.1 拮抗试验在滑子菇菌株鉴别当中的适用性以及局限性

拮抗试验是食用菌菌株初步鉴定所采用的经典生物学方法，它的原理是具有不同遗传背景的菌株菌丝在相互接触之后，会因为体细胞不亲和性而产生拮抗反应。在本研究当中，231个菌株组合里面有90.04%出现拮抗反应，这表明绝大多数供试的菌株之间存在着明显的遗传分化情况，和后续分子标记的分析结果基本上是一致的，证实拮抗试验可以作为滑子菇菌株亲缘关系初步筛选的有效手段。

4.1.2 ISSR分子标记在对滑子菇种内遗传多样性进行解析方面的核心优势

本研究筛选出来的6条ISSR引物，总的多态性比率达到89.83%，远远高于真菌物种鉴定所需要的多态性阈值，这证实ISSR标记在滑子菇当中具有非常高的多态性检测效率。和ITS序列分析相比较，ITS序列作为真菌DNA条形码的核心序列，能够精准地实现对鳞伞属种水平的物种进行区分，在本研究当中ITS序列把21个菌株划分成3个不同的物种，明确供试菌株的物种分类地位；但是ITS序列在种内菌株之间的变异度非常低，没有办法区分同一物种内的不同菌株，而ISSR标记能够有效地检测种内菌株之间的微小遗传差异，在本研究当中ISSR标记把同一物种内的菌株进一步划分成多个类群，清晰地解析种内菌株之间的亲缘关系。

4.1.3 本研究对于滑子菇种质资源整理以及产业规范化发展所具有的实践意义

当前中国滑子菇产业所面临的核心瓶颈之一是种质资源比较混乱，同物异名、同名异物的现象普遍存在，这不仅导致品种权侵权事件频繁发生，也严重地制约滑子菇的遗传育种工作。本研究结果显示，市售名称相近的滑子菇菌株，实际上分属于不同的物种，例如名称均包含“滑1号”的P3、P4菌株，分别聚类到不同的类群，遗传差异非常显著；而来源不同、名称不同的菌株，例如P12与P14、P11与P15，遗传相似系数非常高，可能存在同物异名的情况，这证实当前滑子菇种质资源混乱的现状。

4.2 结论

1）供试的21个滑子菇菌株在菌丝形态、生长速率上存在显著差异（P<0.05），90.04%的菌株组合间存在明显的拮抗反应，证实菌株间存在广泛的遗传分化；

2）ITS序列分析可将供试菌株精准划分为小孢鳞伞、光帽鳞伞、柠檬鳞伞3个物种，其中光帽鳞伞为优势类群，占供试菌株的61.9%，明确供试菌株的物种分类地位；

3）筛选获得6条多态性良好的ISSR引物，总多态性比率达89.83%，菌株间遗传相似系数介于0.19~0.91之间，在相似系数0.42水平上可划分为4个类群，证实供试滑子菇菌株具有丰富的遗传多样性；

4）建立的形态学观察-拮抗试验-ITS序列-ISSR标记多技术联合鉴定体系，可有效区分滑子菇不同物种与菌株，为滑子菇种质资源鉴定、品种权保护与遗传育种工作提供科学的理论依据。

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基金资助

陕西省秦创原“科学家+工程师”队伍建设项目(2025QCY-KXJ-128)

陕西省科技创新团队项目(2023-CX-TD-40)

陕西省重点研发计划项目(2025NC-YBXM-078)

延安市科技计划项目(2024-QYL-076)

陕西省教育厅重点科学研究计划项目(24JR165)