AtGRF5通过调控抗氧化系统与JA信号通路增强拟南芥对镉胁迫的耐受性

AtGRF5 enhances Cd stress tolerance by modulating antioxidant system and JA signaling in Arabidopsis

摘要

为了阐明生长调节因子AtGRF5转录因子调控拟南芥抗Cd毒害的作用和分子机制，通过生物信息学方法分析AtGRF5蛋白的结构域和其他物种中的同源蛋白，利用RT-qPCR技术检测AtGRF5在不同Cd浓度和不同处理时间下的表达水平；测定AtGRF5突变体atgrf5-1、atgrf5-2和野生型WT在0、25、50和75 μmol/L CdSO₄处理下的表型、根长、鲜重和最大光合效率Fv/Fm；在25 μmol/L CdSO₄处理0、3和5 d后，测定atgrf5-1、atgrf5-2和野生型WT的Cd浓度、H₂O₂含量和抗氧化酶活性；同时利用转录组测序分析25 μmol/L CdSO₄处理6 h后atgrf5-1和野生型WT中的差异表达基因。结果表明，AtGRF5蛋白含有GRF家族典型的QLQ和WRC保守结构域，与萝卜（Raphanus sativus）中的RsGRF5具有较高同源性。与对照相比，Cd胁迫显著诱导了AtGRF5的表达。在Cd胁迫下，与野生型WT相比，atgrf5-1和atgrf5-2突变株系根长、鲜重和最大光合效率Fv/Fm显著降低，并伴随着较高的Cd浓度和H₂O₂含量，以及较低的CAT、APX和POD的活性。转录组测序分析发现，在Cd胁迫下，与野生型WT相比，突变体atgrf5-1中Cd耐受性相关转录因子（AtZAT6和AtZAT10）、解毒和抗氧化相关基因（AtGST2、AtGST22和AtGST30）以及茉莉酸途径相关基因（AtMYC2、AtJAZ1、AtJAZ5、AtLOX2和AtLOX4）的表达下调。因此，AtGRF5通过调控Cd胁迫相关基因的表达，增强抗氧化能力并降低Cd的累积，从而增强拟南芥对Cd毒害的耐受性。本研究可为提高植物对Cd毒害的耐受性提供理论依据和基因资源。

Abstract

To elucidate the role and molecular mechanism of GROWTH-REGULATING FACTOR 5 （AtGRF5） in modulating cadmium （Cd） tolerance in Arabidopsis， bioinformatic approaches were utilized to analyze the protein structural domains of AtGRF5 and its homologous proteins across different species. The expression levels of AtGRF5 under varying Cd concentrations and treatment durations were assessed using RT-qPCR. The phenotypic characteristics， including root length， fresh weight， and maximum photosynthetic efficiency （Fv/Fm）， of the AtGRF5 mutants atgrf5-1 and atgrf5-2， as well as wild-type （WT） plants， were evaluated under treatments with 0， 25， 50， and 75 μmol/L CdSO₄. Following exposure to 25 μmol/L CdSO₄ for 0， 3， and 5 days， the Cd concentration， H₂O₂ content， and antioxidant enzyme activities were quantified in atgrf5-1， atgrf5-2， and WT plants. Furthermore， transcriptome sequencing was conducted to identify differentially expressed genes in atgrf5-1 and WT plants after 6 hours of treatment with 25 μmol/L CdSO₄. The result show that the AtGRF5 protein possesses the characteristic conserved QLQ and WRC domains typical of the GRF family and shares significant homology with RsGRF5 from radish （Raphanus sativus）. Under cadmium （Cd） stress conditions， the expression of AtGRF5 was significantly upregulated compared to the control. In response to Cd stress， the atgrf5-1 and atgrf5-2 mutant lines exhibited significantly reduced root length， fresh weight， and Fv/Fm values relative to wild-type （WT） plants. This was accompanied by elevated Cd concentrations and increased hydrogen peroxide （H₂O₂） levels， alongside decreased activities of catalase （CAT）， ascorbate peroxidase （APX） and peroxidase （POD）. Transcriptome sequencing analysis indicated that， under Cd stress， the expression of genes associated with Cd tolerance， including transcription factors （AtZAT6 and AtZAT10）， detoxification and antioxidant-related genes （AtGST2， AtGST22， and AtGST30）， as well as genes related to the jasmonic acid pathway （AtMYC2， AtJAZ1， AtJAZ5， AtLOX2 and AtLOX4） was downregulated in the atgrf5-1 mutant compared to WT plants. Consequently， the transcription factor AtGRF5 augments antioxidant capacity and mitigates Cd accumulation by modulating the expression of genes associated with Cd stress， thereby enhancing Arabidopsis tolerance to Cd toxicity. This research offers a theoretical foundation and genetic resources for improving plant resilience to Cd stress.

Graphical abstract

关键词

镉毒害 / 生长调节因子5 / 转录因子 / 解毒 / 抗氧化

Key words

Cd toxicity / AtGRF5 / transcription factor / detoxification / antioxidant

农业土壤中的重金属污染，尤其镉（Cd）污染，已经成为毒性高、难降解、分布范围广和污染周期长的重大环境问题，严重威胁农业生产和粮食安全^［1-2］。植物受到Cd胁迫后，会抑制叶绿素的合成和根系的伸长，导致新生叶片出现萎黄和根系生长减弱，最终引发植株矮小乃至死亡^［3-4］。

生长调节因子GROWTH REGULATING FACTOR（GRF）家族是植物特有的一类小型的转录因子家族，在植物生长发育过程中发挥着至关重要的作用^［5-7］。最早被报道的水稻OsGRF1能够响应赤霉素（GA）诱导，进而调控水稻茎秆伸长^［8］。拟南芥AtGRF家族包含9个成员，它们参与调控叶片形态、叶柄生长、开花时间及叶片衰老等多个发育过程^［6，9］。此外，部分研究结果证实，GRF家族成员还参与激素信号转导过程，并整合到多种逆境响应通路中^［5］。例如，AtGRF7可通过抑制干旱应答元件结合蛋白2A（Dehydration-responsive element-binding protein 2A，DREB2A），参与到干旱和高温等胁迫响应过程，从而在植物生长发育和逆境胁迫响应之间实现平衡调节^［10］；AtGRF5可通过与DELLA蛋白互作参与GA信号途径以及冷胁迫应答，过表达株系在冷胁迫后恢复能力更强^［11］。另外，AtGRF5还能促进抗坏血酸合成，通过增强抗氧化能力减轻非生物胁迫造成的氧化损伤^［12］。与此同时，GRF家族还可通过miR396-GRF模块参与重金属胁迫相关的调控过程^［13］。由此可见，GRF家族在植物应对逆境胁迫过程中扮演着关键角色。然而，与对其它转录因子家族研究相比，GRFs调控植物响应Cd毒害的生理、遗传和分子调控机制，目前均尚未明确。

为有效抵御Cd毒害，植物形成了多种潜在的抵抗途径与机制，包括对Cd元素进行固定与隔离，从而限制Cd的吸收与转运；通过激活自身的抗氧化系统，清除Cd胁迫所诱导产生的活性氧（ROS）；启动解毒相关通路，缓解细胞因Cd毒害而遭受的损伤等^［14-20］。具体而言，植物可通过调控根细胞膜上金属离子转运蛋白的表达与活性，减少对Cd的摄取和向地上部的转运^［21］；同时，清除过量ROS、有效缓解氧化损伤对细胞造成的危害^［22］。此外，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）等激素在植物应对Cd胁迫过程中也发挥着至关重要的作用。它们可以通过抑制Cd吸收与转运相关基因的表达，调控抗氧化系统活性，从而减轻Cd对植物生长和发育的毒害影响^［23-24］。

本研究通过基因的生物信息学分析、表达模式分析、突变体表型分析、Cd含量测定和转录组测序等试验手段，探究了AtGRF5在拟南芥抗Cd毒害过程中的作用，为提高植物对Cd毒害的耐受性提供了基因资源。

1 材料和方法

1.1 材料

2022—2025年期间，试验在延安大学陕西省黄土高原资源植物研究与利用重点实验室进行，拟南芥野生型Col-0种子由本实验室保存，T-DNA插入的AtGRF5突变体atgrf5-1（CS750936）和atgrf5-2（CS750939）种子来源于美国拟南芥种质资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center， ABRC）种子库，采用T-DNA引物8474： 5´ATAATAACGCTGCGGACATCTACATTTT3´和AtGRF5位点特异引物BW69： 5´GCATGATGAAGAGTTTGTTGTTGT3´鉴定突变体株系。试验材料在本课题组的光照培养箱（顶部冷光源）中进行，光照强度150 µmol·photons·m^-2·s^-1，温度22±2 ℃，光照16 h/黑暗8 h。

1.2 方法

1.2.1 AtGRF5基因生物信息学分析

通过MEGA11.0分别构建拟南芥生长调控因子GRF家族成员之间、AtGRF5与其他物种同源蛋白的系统发育树。使用InterPro数据库（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）分析AtGRF5蛋白结构域。

在TAIR上提取AtGRF5基因起始密码子ATG上游2 000 bp的启动子序列，ID号为AT3G13960。通过PlantCARE网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析AtGRF5启动子上潜在的顺式作用元件。

1.2.2 AtGRF5基因表达模式分析

将1 µg RNA反转录成cDNA。随后，在Thermofisher Scientific的StepOnePlus Real-Time PCR System上进行基因表达分析。采用{\mathrm{2}}^{-\mathrm{\Delta }\mathrm{\Delta }\mathrm{C}\mathrm{t}}方法计算AtGRF5（上游引物：5´TCAGTTCAATGTCTTAGCCTCTGC3´；下游引物：5´CCCAACTCCTCCAACTCTCTCC3´）基因的相对表达；AtUBQ10（AT4G05320，上游引物：5´TCCTCAGGCTCCGTGGTGGT3´；下游引物：5´AGCCTCTGCTGGTCCGGAGG3´）作为内参基因，每个样品进行了3个独立的生物学重复，每个重复2个技术重复^［25］。

1.2.3 Cd胁迫处理AtGRF5突变体和野生型

表型观察：将播种好的培养皿4 ℃低温下处理2 d^［18］。随后，将培养皿放置于光照培养箱中培养，培养9 d后，进行拍照记录、统计根长和鲜重以及采用叶绿素荧光仪分析最大光合效率Fv/Fm。

生理指标测定：将在1/2 MS固体培养基上生长7 d的atgrf5-1、atgrf5-2和WT幼苗移到含有25 μmol/L CdSO₄的1/2 MS固体培养基上，处理0、3和5 d后，分别进行Cd浓度、H₂O₂含量和植物保护酶（CAT、APX和POD）活性的检测。

1.2.4 Cd浓度测定

将待测拟南芥植株地上部和地下部样本用超纯水冲洗3次，每次持续3 min，分别称重后，放于硝煮管中。随后，加入1 mL浓HNO₃进行消化处理，待溶液澄清后定容到10 mL并充分混匀。最后，待测溶液采用滤纸过滤后，在Thermo Scientific公司的ICP-AES（IRIS）仪器上利用电感耦合等离子体-原子发射光谱法对Cd含量进行检测。

1.2.5 H₂O₂含量和植物保护酶活性测定

使用组织碾磨仪将80 mg左右的待测样本进行低温碾磨。根据上海邦奕生物技术有限公司（Shanghai Bangyi Biotechnology Co， Ltd， Shanghai）提供的ELISA试剂盒和说明书，分析待测样本中H₂O₂含量、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性。随后，在450 nm波长下使用Tecan公司Tecan Infinite 200 Pro Plate Reader酶标仪检测各待测样品的吸光值。根据测定吸光值和标准曲线，换算出样品中的H₂O₂含量、POD、CAT和APX的酶活性。

1.2.6 转录组测序

将Cd胁迫处理后6 h的atgrf5-1和WT幼苗通过Invitrogen公司的TRIzol提取总RNA。随后，百迈克（Biomarker Technologies）公司构建cDNA文库并进行Illumina HiSeq测序。原始数据经质控过滤后，使用HISAT2（v2.2.1）软件比对到拟南芥参考基因组（TAIR10），采用FeatureCounts（v2.0.1）进行基因表达量定量。差异表达基因（DEGs， Differentially Expressed Genes）筛选采用DESeq2软件，筛选阈值设定为错误发现率（FDR， False Discovery Rate）<0.01且倍数变化（Fold Change）≥1.5。最后，利用TBtools Ⅱ软件绘制了热图^［26］，通过热图可视化差异表达的基因。

1.2.7 数据分析

本实验均进行了至少三个生物学重复，所得数据为各重复实验的平均值。采用DPS统计软件中的Student’s t检验或Tukey多重比较检验对组间差异进行统计学评估，以星号标注的差异被认为具有统计学显著性，其中*P<0.05表示差异显著，**P<0.01表示差异极显著。

1.2.8 基因登录号

本研究序列数据可以在美国国家生物技术信息中心（NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）或茄科数据（https：//www.sgn.cornell.edu/）下载，登录号如下：番茄SlGRF5（XP_004243717；Solyc07g041640）、马铃薯StGRF5（KAH0650552；Sotub07g014780）、黄瓜CsGRF5（XP_011651737；CsaV3_3G031320）、油菜BnGRF5（XP_048635827）、烟草NtGRF5（XP_016449439；Nitab4.5_0007826g0010）、萝卜RsGRF5（KAJ4893568）、辣椒CaGRF5（XP 016539546；Caz08g21410）和茄子SmGRF5（SMEL4.1_07g012460）。

2 结果与分析

2.1 拟南芥AtGRF5的生物信息学分析及表达模式

系统发育分析结果表明AtGRF5与AtGRF6亲缘关系最近（见知网增强出版附件图1A）。AtGRF5编码397个氨基酸序列，具有典型的QLQ结构域和WRC结构域，登录号分别为IPR014978和IPR014977，属于GRF家族成员且具有高度保守性（见知网增强出版附件图1B）。拟南芥AtGRF5与萝卜RsGRF5同源性较高，相似度达到81.77%。此外，AtGRF5与番茄SlGRF5、马铃薯StGRF5和辣椒CaGRF5相似度为33.33%、31.83%和18.95%，相比之下，SlGRF5和StGRF5相似度达为95.07%（见知网增强出版附件图1C）。这些结果说明AtGRF5在十字花科作物中比较保守，在不同科作物中保守性差异比较大。

如知网增强出版附件表1所示，AtGRF5启动子上包括植物激素响应，防御和胁迫响应元件以及低温响应元件等8类顺式作用元件，此外还包含2个对JA有响应的元件CGTCA-motif。如知网增强出版附件图1D所示，与对照组相比，在Cd处理后3、6和12 h，AtGRF5的表达量均显著高于对照组，且在处理后6 h达到表达峰值。进一步分析发现，5和50 μmol/L CdSO₄的处理均显著诱导了AtGRF5的表达（见知网增强出版附件图1E）。总之，这些结果表明AtGRF5可能参与了拟南芥对Cd胁迫的响应过程。

2.2 拟南芥AtGRF5在Cd胁迫中的功能分析

如知网增强出版附件图2A所示，采用AtGRF5基因外显子T-DNA插入的突变体分析AtGRF5在拟南芥抗Cd胁迫中的作用。如知网增强出版附件图2B-D所示，在不含Cd的对照培养基培养9 d后，突变体株系atgrf5-1、atgrf5-2和野生型WT植株大小及主根伸长情况一致，叶片生长良好，整体生长状况无明显的差异。相比之下，在25、50和75 μmol/L CdSO₄处理下，尽管所有植株的大小和主根伸长都受到明显抑制，但突变体株系atgrf5-1和atgrf5-2的植株大小和主根伸长的抑制程度相较于野生型WT更严重，推测AtGRF5可能在拟南芥对Cd胁迫的抗性中起到调控作用。

2.3 AtGRF5的突变对Cd胁迫下拟南芥最大光合效率Fv/Fm的影响

如图1所示，在不含Cd的对照培养基培养9 d后，突变体株系atgrf5-1、atgrf5-2和野生型WT幼苗最大光合效率Fv/Fm无显著差异。相比之下，在25、50和75 μmol/L CdSO₄处理下，突变体株系atgrf5-1和atgrf5-2幼苗的最大光合效率Fv/Fm显著低于WT，说明AtGRF5的突变降低了拟南芥对Cd胁迫的耐受性。

2.4 AtGRF5的突变对Cd胁迫下拟南芥Cd累积的影响

如图2所示，与WT相比，突变体株系atgrf5-1和atgrf5-2幼苗地上部和地下部均积累了更多的Cd离子，说明AtGRF5可能通过抑制Cd吸收和Cd转运增强了拟南芥对Cd胁迫的耐受性。

2.5 AtGRF5的突变对Cd胁迫下拟南芥H₂O₂的产生和植物保护酶活性的影响

如图3所示，Cd胁迫处理前突变体株系atgrf5-1、atgrf5-2和野生型WT幼苗中的H₂O₂含量以及CAT、APX和POD酶的活性无显著差异。相比之下，在Cd胁迫后第3和5 d，突变体株系atgrf5-1、atgrf5-2幼苗中的H₂O₂含量显著高于野生型WT，相反，植物保护酶CAT、APX和POD的活性显著低于野生型WT。说明AtGRF5可能通过调控H₂O₂的产生以及CAT、APX和POD酶的活性途径增强了拟南芥对Cd胁迫的耐受性。

综上所述，AtGRF5转录因子通过调控Cd的吸收和转运、最大光合效率Fv/Fm、H₂O₂的产生以及CAT、APX和POD酶的活性提高了拟南芥对Cd胁迫的耐受性。

2.6 AtGRF5的突变对Cd胁迫下拟南芥转录因子、解毒和抗氧化酶及JA信号途径相关基因表达的影响及分析

转录组测序结果表明，与野生型WT相比，转录因子AtMYC2、AtZAT6、AtZAT10、AtWRKY45、AtERF13、AtERF71和AtNAC2在atgrf5-1中表达下调（图4A），先前的研究报道过转录因子AtZAT6和AtZAT10正调控了拟南芥对Cd胁迫的抗性^{［19-20，23］}。此外，解毒和抗氧化相关基因（AtGST2、AtGSTU22和AtGST30）和JA信号途径相关基因（AtJAZ1、AtJAZ5、AtLOX2和AtLOX4）也在atgrf5-1中表达下调（图4B和4C）。为了验证转录组测序结果，通过RT-qPCR对上述差异表达基因进行了表达量检测，结果与转录组测序结果一致（图4D）。综上，这些结果表明AtGRF5可能通过调控Cd胁迫相关转录因子、解毒和抗氧化相关基因和JA信号途径相关基因的表达影响了拟南芥对Cd胁迫的耐受性。

3 讨论

3.1 AtGRF5在Cd吸收转运中的作用

土壤重金属污染已成为全球性问题，其中Cd作为现代工业活动的副产物进入植物体内的时间相对较短。由于进化时间有限，植物尚未形成能够有效区分必需金属元素（如Fe、Zn、Cu）与有毒金属离子（如Cd）的精细机制^{［16-17，27］}。此外，由于化学性质的相似性，植物在吸收时更难以区分，加剧了Cd对植物的潜在威胁，进而通过食物链危及人类健康^［28-29］。因此，阐明植物Cd耐受的遗传调控机制对于农业安全生产具有现实意义。本研究的结果表明，AtGRF5的突变体株系atgrf5-1和atgrf5-2比野生型WT对Cd胁迫更敏感（见知网增强出版附件图2）。Cd胁迫下，atgrf5-1和atgrf5-2株系地下部和地上部中的Cd离子含量显著高于野生型WT（图2），这说明AtGRF5可以通过抑制Cd的吸收和转运来提高拟南芥对Cd胁迫的耐受性，但AtGRF5如何抑制Cd离子的吸收和转运，仍需要进一步深入研究。

3.2 AtGRF5与ROS调控

Cd胁迫会干扰正常代谢过程，破坏细胞内ROS稳态并诱导ROS积累，其中H₂O₂因半衰期较长而相对稳定，是衡量氧化胁迫的重要指标^{［27，30］}。

在本研究中，在Cd处理后3和5 d，atgrf5-1和atgrf5-2株系中H₂O₂的含量明显高于野生型WT（图3），这说明AtGRF5可以通过调控ROS的累积影响拟南芥对Cd胁迫耐受性。前期研究发现AtZAT10通过降低Cd胁迫诱导的H₂O₂的累积正调控了拟南芥对Cd胁迫的耐受性^［29］。此外，大量的研究表明这些保护酶能够清除Cd胁迫诱导产生的ROS，避免细胞受到损伤，从而提高植物对Cd胁迫的耐受性^{［22，31］}。

3.3 AtGRF5与JA信号通路的关联

挖掘植物抗Cd胁迫的关键基因及其调控网络，有助于理解植物对Cd胁迫的响应机制，并为培育抗Cd作物提供理论依据。利用转录组测序技术能快速了解AtGRF5在拟南芥响应Cd胁迫过程中的遗传途径及其作用机制，结果表明Cd胁迫下，与野生型WT相比，转录因子AtZAT6和AtZAT10在atgrf5-1中表达下调（图4A），表明AtGRF5有可能通过调控AtZAT6和AtZAT10的表达影响拟南芥对Cd胁迫的抗性。先前研究发现与野生型相比，过量表达AtZAT6的拟南芥植株表现出对Cd胁迫更高的耐受性，相反，AtZAT6的突变株系则对Cd胁迫更敏感^［32］，以及本文的研究也发现AtZAT10的突变株系比野生型对Cd胁迫更敏感^［29］。此外，本研究也发现JA信号途径相关基因（AtMYC2、AtJAZ1、AtJAZ5、AtLOX2和AtLOX4）在atgrf5-1中表达下调（图4C），已有研究指出，JA可通过抑制根系Cd吸收相关基因AtIRT1以及Cd转运相关基因AtHMA2与AtHMA4的表达，降低根细胞和地上部Cd浓度，从而缓解Cd毒害引起的新叶失绿^［23］。同时，研究也报道外源JA处理能够缓解Cd胁迫毒害并提高耐受性^［33］。这些结果暗示AtGRF5有可能通过JA信号途径调控了拟南芥对Cd胁迫的响应过程。

4 结论

本研究揭示了AtGRF5在拟南芥抗Cd胁迫过程中的新功能，并对其调控机制进行了初步阐释。这些研究成果为利用AtGRF5增强作物对Cd胁迫的耐受性方面的应用奠定了分子基础。

特别提醒：本文的附件材料见知网增强出版附件。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32360763)

延安大学博士科研启动项目(YAU202313800)

大学生创新训练计划项目(S202510719157)