大黄鱼杀香鱼假单胞菌TaqMan实时荧光定量（qRT-PCR）检测方法的建立及应用

摘要

为建立一种快速、准确检测杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）的方法，并为该病菌的早期诊断和流行病学调查提供技术支持，本研究基于杀香鱼假单胞菌的gyrB基因保守区域，设计了特异性引物和TaqMan探针，通过优化反应体系与扩增条件，建立了TaqMan实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测方法。结果显示，在1.1×10⁹～1.1×10¹copies·μL～（-1）的范围内，C_t值和标准质粒浓度呈现良好的线性关系，Y（C_t）=-3.337X+40.344，相关系数R²为0.997；与常见的养殖大黄鱼（Larimichthys crocea）的细菌性和病毒性病原如芽孢杆菌（Bacillus sp.）、嗜冷杆菌（Psychrobacter sp.）、摩根氏菌（Morganella sp.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、气单胞菌（Aeromonas sp.）、大黄鱼虹彩病毒（LYCIV-FD2022）均无交叉反应，特异性强，且该方法的最低检测极限为1.1×10¹copies·μL～（-1），较常规PCR灵敏度提高约1 000倍。重复性试验结果显示，组内和组间的变异系数（CV）均在1%以下。对292份大黄鱼临床样本进行检测，检出率为66.78%。本方法和常规PCR方法59.59%的检出率相比，表现出精密、严谨的临床适用性。综上所述，本研究建立的方法具有较高的特异性、灵敏性和重复性，可用于杀香鱼假单胞菌的快速检测及流行病学调查。

关键词

大黄鱼 / 杀香鱼假单胞菌 / TaqMan qRT-PCR / 检测方法

基金资助

中央公益性科研院所基本科研业务费(2022-ZD-01、2023TD43); 上海市启明星项目—扬帆专项(22YF1459800)