巨噬细胞富集lncRNA CCL3-AS1在颈动脉斑块不稳定中的表达及作用机制

摘要

背景与目的：颈动脉斑块不稳定性是缺血性脑卒中发生的重要病理基础，寻找关键分子标志物以评估斑块稳定性具有重要临床意义。近年来的研究强调了长链非编码RNA（lncRNA）在斑块稳定性中的重要调控作用和预警价值。笔者前期对人颈动脉稳定和不稳定斑块组织进行全转录组测序，发现lncRNA趋化因子3反义RNA 1（CCL3-AS1）在不稳定斑块中高表达，可能与斑块稳定性密切相关。因此，本研究进一步扩大斑块组织样本量验证，并探讨CCL3-AS1对颈动脉斑块稳定性的影响及分子机制。方法：收集颈动脉内膜剥脱术患者的斑块组织，HE和天狼星红等病理染色方法将其分为稳定斑块组和不稳定斑块组（n=15/组），采用q RT-PCR对候选的差异lncRNA CCL3-AS1的表达进行验证。用RNA原位杂交联合免疫荧光技术确定其在斑块组织中的定位及与巨噬细胞的共表达关系。体外实验中，通过慢病毒或反义寡核苷酸（ASO）分别上调或敲低THP1来源巨噬细胞中CCL3-AS1表达，检测炎症因子及基质金属蛋白酶（MMP）的变化。体内通过载脂蛋白E敲除(ApoE^-/-)小鼠右颈动脉串联结扎构建不稳定斑块模型，并局部过表达CCL3-AS1，评估其对斑块形态、炎性巨噬细胞浸润及MMP-9表达的影响。进一步基于catRAPID omics v2.1平台进行生物信息学预测，筛选CCL3-AS1潜在结合蛋白，并结合RNA稳定性实验与RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验，验证其调控MMP-9表达的机制。结果：结果显示，CCL3-AS1在不稳定颈动脉斑块中呈明显高表达，并主要定位于斑块中巨噬细胞的胞浆。体外实验显示，CCL3-AS1过表达可明显上调巨噬细胞中MCP-1、TNF-α、IL-1β、iNOS及MMP-9的表达，敲低则相反。在ApoE^-/-小鼠的颈动脉不稳定斑块模型中，CCL3-AS1过表达诱导斑块纤维帽破裂、炎性巨噬细胞聚集及MMP-9分泌增强，促进斑块不稳定。共表达分析提示CCL3-AS1与MMP-9表达高度相关（r=0.89,P=0.001）,RNA稳定性实验显示其可延缓MMP-9 mRNA降解。生物信息学预测发现CCL3-AS1可能与hnRNP-K蛋白结合，RIP实验和组织FISH共定位进一步证实该相互作用，提示CCL3-AS1通过与hnRNP-K结合增强MMP-9 mRNA稳定性，进而促进其表达。结论：lncRNA CCL3-AS1作为巨噬细胞中富集的炎症调控因子，可能通过hnRNP-K介导的MMP-9表达促进颈动脉斑块不稳定，为缺血性脑卒中的早期干预和分子分型提供潜在靶点。

关键词

斑块,动脉粥样硬化 / 颈动脉 / RNA,长链非编码 / 巨噬细胞