PAI-1基因多态性与糖尿病肾病患者并发脑梗死的关系研究

Association between PAI-1 gene polymorphisms and cerebral infarction in patients with diabetic nephropathy

摘要

目的 探讨纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）基因多态性与糖尿病肾病（DN）患者并发脑梗死的关系。 方法 回顾性2020年1月—2023年12月大庆龙南医院收治的149例DN患者的资料，其中DN并发脑梗死患者68例（DN并发脑梗死组）、单纯DN患者81例（DN未并发脑梗死组）。比较两组患者PAI-1基因多态性；采用多因素一般Logistic回归分析DN患者并发脑梗死的影响因素；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析PAI-1基因多态性预测DN患者并发脑梗死的价值。 结果 两组患者PAI-1基因的4G/4G、4G/5G和5G/5G基因频率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；DN并发脑梗死组PAI-1基因的4G/4G基因频率高于DN未并发脑梗死组。两组患者PAI-1基因的4G等位基因和5G等位基因构成比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；DN并发脑梗死组的4G等位基因构成高于DN未并发脑梗死组（P < 0.05）。两组的性别构成、年龄、体质量指数、吸烟率、饮酒率、高血压患病率、高脂血症患病率、冠心病患病率、收缩压、舒张压、既往用药史构成、T2DM病程、糖化血红蛋白水平、心脑血管事件发生率、UAER水平、残余肾功能水平、24 h尿量、残余肾小球滤过率、CysC水平、血红蛋白水平、血清白蛋白水平、血肌酐水平、血尿酸水平、血尿素氮水平、血钙水平、血磷水平、空腹血糖水平、TG水平和HDL-C水平的比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。DN并发脑梗死组的透析龄、TC水平、LDL-C水平、纤维蛋白原水平、同型半胱氨酸水平均高于DN未并发脑梗死组（P < 0.05），DN并发脑梗死组的尿素清除指数低于DN未并发脑梗死组（P <0.05）。多因素一般Logistic回归分析显示，PAI-1基因4G/4G基因型［O^R=5.859（95% CI：2.003，17.142）］、透析龄大［O^R=4.545（95% CI：1.870，11.046）］、LDL-C水平高［O^R=3.951（95% CI：1.626，9.603）］均为DN患者并发脑梗死的危险因素（P <0.05）。ROC曲线结果显示，透析龄、LDL-C、PAI-1基因多态性单一及联合预测DN患者并发脑梗死的敏感性分别为77.78%（95% CI：0.676，0.853）、87.65%（95% CI：0.782，0.921）、85.19%（95% CI：0.750，0.921）、92.59%（95% CI：0.853，0.964），特异性分别为75.00%（95% CI：0.647，0.833）、70.59%（95% CI：0.600，0.800）、67.65%（95% CI：0.562，0.781）、85.29%（95% CI：0.765，0.914），曲线下面积分别为0.810（95% CI：0.740，0.880）、0.853（95% CI：0.790，0.916）、0.764（95% CI：0.684，0.844）、0.939（95% CI：0.900，0.978）。 结论 PAI-1基因4G/4G基因型、透析龄、LDL-C与DN患者并发脑梗死有关，三者联合预测DN患者并发脑梗死的效能良好。

Abstract

Objective To investigate the relationship between plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) gene polymorphisms (4G/5G) and cerebral infarction (CI) in patients with diabetic nephropathy (DN). Methods Data from 149 DN patients admitted between January 2020 and December 2023 were reviewed: 68 with CI (CI group) and 81 without CI (non-CI group). PAI-1 4G/5G genotype and allele frequencies were determined. Clinical and laboratory data were compared. Multivariate logistic regression identified CI risk factors. ROC analysis evaluated the predictive value of PAI-1 polymorphisms alone and combined with other factors. Results Genotype (4G/4G, 4G/5G, 5G/5G) and allele (4G, 5G) distributions differed significantly between groups (P < 0.05). The CI group had a higher frequency of the 4G/4G genotype and 4G allele (P < 0.05). The CI group had longer dialysis vintage, higher TC, LDL-C, fibrinogen, homocysteine levels, and lower urea clearance index (Kt/V) (P < 0.05). Multivariate analysis identified 4G/4G genotype [O^R = 5.859 (95% CI: 2.003, 17.142) ], longer dialysis vintage [O^R = 4.545 (95% CI: 1.870, 11.046) ], and high LDL-C [O^R = 3.951 (95% CI: 1.626, 9.603) ] as independent risk factors for CI. ROC analysis showed sensitivities for dialysis vintage, LDL-C, PAI-1 polymorphism, and their combination predicting CI were 77.78% (95% CI: 0.676, 0.853), 87.65% (95% CI: 0.782, 0.921), 85.19% (95% CI: 0.750, 0.921), and 92.59% (95% CI: 0.853, 0.964), respectively. Specificities were 75.00% (95% CI: 0.647, 0.833), 70.59% (95% CI: 0.600, 0.800), 67.65% (95% CI: 0.562, 0.781), and 85.29% (95% CI: 0.765, 0.914), respectively. AUCs were 0.810 (95% CI: 0.740, 0.880), 0.853 (95% CI: 0.790, 0.916), 0.764 (95% CI: 0.684, 0.844), and 0.939 (95% CI: 0.900, 0.978), respectively. Conclusion The PAI-1 4G/4G genotype, dialysis vintage, and LDL-C are associated with CI in DN patients. Their combination demonstrates excellent predictive performance.

Graphical abstract

关键词

糖尿病肾病 / 脑梗死 / 纤溶酶原激活剂抑制物-1 / 基因多态性

Key words

diabetic nephropathy / cerebral infarction / plasminogen activator inhibitor-1 / gene polymorphism

糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病患者常见的慢性并发症之一，是影响全球糖尿病患者健康的重要难题^[1-2]。心脑血管事件是导致DN患者死亡的主要原因，超过50%的已知死亡与心脑血管事件相关，其中脑梗死是临床较常见的并发症^[3-4]。目前临床尚缺乏早期识别DN患者并发脑梗死的指标，找寻识别DN并发脑梗死的安全、高效的指标有利于临床针对高危患者及时地干预，改善DN患者预后。DN患者并发脑梗死的机制涉及多个因素，近期研究指出个体遗传因素在脑血管疾病中具有重要作用^[5]。纤溶酶原激活剂抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）是一种重要的纤溶酶系统调节因子，通过抑制纤溶酶原激活剂的活性而影响血栓溶解。PAI-1基因变化可导致其蛋白表达水平改变，进而影响血栓形成和溶解过程，从而增加脑梗死发生风险。相关研究显示，PAI-1基因启动区4G/5G多态性与血栓栓塞、肾病的发生密切相关^[6-7]。但目前关于PAI-1基因多态性与DN患者并发脑梗死的关系及其对DN患者并发脑梗死的预测价值尚缺乏报道。鉴于此，本研究拟探讨PAI-1基因多态性对DN患者并发脑梗死的预测价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1　一般资料

回顾性分析2020年1月—2023年12月大庆龙南医院收治的149例DN患者的资料，其中，DN并发脑梗死患者68例（DN并发脑梗死组）、单纯DN患者81例（DN未并发脑梗死组）。纳入标准：①符合《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》^[8]中T2DM诊断标准；②符合《糖尿病肾脏疾病临床诊疗中国指南》^[9]中DN诊断标准；③符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》^[10]中脑梗死诊断标准；④进行维持性血液透析治疗；⑤年龄>18岁；⑥临床资料完整；⑦患者对本研究知情同意并签署知情同意书。排除标准：①伴有脑炎、颅内动脉瘤、脑血管畸形、脑内出血及活动性内出血者；②有颅脑手术史、桥接血管内治疗史、肾移植手术者；③有重要脏器功能障碍、阿尔茨海默病、帕金森病等疾病者；④有免疫缺陷、传染性疾病、血液系统疾病者；⑤有先天性心脏病、原发性肾脏疾病者；⑥短暂性脑缺血发作者；⑦入院不足24 h死亡或转院者；⑧无法配合完成本研究者。本研究经医院医学伦理委员会审核批准（伦理审批号：2023-01-088-H01）

1.2　方法

1.2.1　维持性血液透析治疗方案

一次性透析器膜材料为聚砜膜（面积为1.3～1.5 m²），标准碳酸氢钠透析液，血流量为200～300 mL/min，3次/周，4 h/次，透析中使用普通肝素或低分子肝素抗凝。

1.2.2　资料收集

包括性别、年龄、体质量指数、吸烟史、饮酒史、基础疾病、收缩压、舒张压、既往用药史、T2DM病程、糖化血红蛋白、透析龄、心脑血管事件史、尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate, UAER）、残余肾功能、24 h尿量、残余肾小球滤过率、尿素清除指数、胱抑素C（Cystatin C, CysC）、血红蛋白、血清白蛋白、血肌酐、血尿酸、血尿素氮、血钙、血磷、空腹血糖、甘油三酯（Triglycerides, TG）、总胆固醇（total cholesterol, TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、纤维蛋白原、同型半胱氨酸。

1.2.3　PAI-1基因多态性测定

患者入院后使用EDTA抗凝剂的真空采血管采集空腹静脉血4 mL，颠倒EDTA抗凝管数次混匀，保证抗凝效果，并在抗凝管外部标签纸上详细登记好血样信息，备用。未能及时检测的全血样本置于2～8 ℃保存，且不超过7 d。采用“一步法”处理样本并上机检测：试剂室温静置溶化，瞬时离心，备用全血颠倒混匀，吸取10 μL加入到400 μL样本萃取液（CQ-ENH型）中混匀，静置1 min样本变为褐色，取1.0 μL样本加入到试剂管壁，离心，上机检测。实验采用改良的液态匀相原位杂交技术，在多通道荧光定量分析仪上进行基因检测；在杂交中有两个温控过程：90～95 ℃变性，DNA双链打开形成两条单链；60 ℃退火，特异性双Z型探针和DNA单链进行原位杂交，目标探针杂交目标基因位点，定位探针杂交临近基因位点。双Z探针杂交后，立体构型荧光放大系统发光并被捕捉，经过曲线分析后解读成基因型别。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示，比较用 t 检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ² 检验；影响因素的分析采用多因素一般Logistic回归模型。绘制受试者工作特征（receiver operator characteristic, ROC）曲线。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　两组基本资料比较

两组患者的性别构成、年龄、体质量指数、吸烟率、饮酒率、高血压患病率、高脂血症患病率、冠心病患病率、收缩压、舒张压、既往用药史构成、T2DM病程、糖化血红蛋白水平、心脑血管事件发生率、UAER水平、残余肾功能水平、24 h尿量、残余肾小球滤过率、CysC水平、血红蛋白水平、血清白蛋白水平、血肌酐水平、血尿酸水平、血尿素氮水平、血钙水平、血磷水平、空腹血糖水平、TG水平和HDL-C水平的比较，经t /χ²检验，差异均无统计学意义（P >0.05）。两组的透析龄、TC水平、LDL-C水平、纤维蛋白原水平、同型半胱氨酸水平和尿素清除指数的比较，经t检验，差异均有统计学意义（P <0.05）；DN并发脑梗死组的透析龄、TC水平、LDL-C水平、纤维蛋白原水平、同型半胱氨酸水平均高于DN未并发脑梗死组，DN并发脑梗死组的尿素清除指数低于DN未并发脑梗死组。见表1。

2.2　两组PAI-1基因多态性比较

PAI-1基因的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ² =0.123，P =0.351）。DN并发脑梗死组与DN未并发脑梗死组PAI-1基因的4G/4G、4G/5G和5G/5G基因频率构成比较，经χ² 检验，差异有统计学意义（P <0.05）；DN并发脑梗死组PAI-1基因PAI-1基因4G/4G基因频率高于DN未并发脑梗死组。DN并发脑梗死组与DN未并发脑梗死组PAI-1基因4G等位基因和5G等位基因构成比较，经χ² 检验，差异有统计学意义（P <0.05）；DN并发脑梗死组PAI-1基因4G等位基因构成高于DN未并发脑梗死组。见表2。

2.3　DN患者并发脑梗死的影响因素分析

以DN患者是否并发脑梗死（否 = 0，是 = 1）为因变量，PAI-1基因型（5G/5G基因型和4G/5G基因型 = 0，4G/4G基因型 = 1）及透析龄、TC水平、LDL-C水平、尿素清除指数、纤维蛋白原水平和同型半胱氨酸水平（均为实测值）为自变量，进行多因素一般Logistic回归分析，结果显示：PAI-1基因4G/4G基因型[O^R = 5.859（95% CI：2.003，17.142）]、透析龄大[O^R = 4.545（95% CI：1.870，11.046）]、LDL-C水平高[O^R = 3.951（95% CI：1.626，9.603）]均为DN患者并发脑梗死的危险因素（P < 0.05）。见表3。

2.4　透析龄、LDL-C、PAI-1基因多态性单一及联合预测DN患者并发脑梗死的价值分析

ROC曲线结果显示，透析龄、LDL-C、PAI-1基因多态性单一及联合预测DN患者并发脑梗死的敏感性分别为77.78%、87.65%、85.19%、92.59%，特异性分别为75.00%、70.59%、67.65%、85.29%，曲线下面积分别为0.810、0.853、0.764、0.939。见表4和图1。

3 讨论

DN患者的高血糖状态会损害血管内皮细胞，造成血管扩张能力下降、血管壁增生、血管壁硬化等病理改变，血管功能损伤可增加动脉硬化和血管病变的风险，这是脑梗死的直接诱因之一；其次，DN会导致肾功能下降，使体内水钠潴留、血容量增加，从而增加高血压和心血管疾病的发生率，进而增加脑梗死的危险性；此外，DN患者血液透析可出现电解质紊乱症状，造成血管狭窄，是脑血管疾病的危险因素^[11-14]。PAI-1基因多态性可影响PAI-1蛋白的表达水平和活性，进而影响血栓形成和溶解过程，增加脑梗死发生风险。

本研究结果显示，DN并发脑梗死组PAI-1基因的4G/4G基因频率、4G等位基因频率均高于DN未并发脑梗死组，提示PAI-1基因4G/4G基因型可能与DN并发脑梗死有关。PAI-1通过抑制纤溶酶原激活剂（tPA/uPA）活性调控纤溶平衡。4G/4G基因型携带者PAI-1转录活性增强，血浆PAI-1水平升高，导致纤维蛋白溶解能力下降，血栓形成风险增加^[15-16]。PAI-1不仅是血栓调节因子，还是DN进展的重要核心参与者。糖基化终产物通过激活NF-κB通路，促进PAI-1的转录，进而抑制纤溶活性，导致肾小球内微血栓的形成^[17]。此外，PAI-1通过抑制基质金属蛋白酶的活性，促进细胞外基质的积累，加速肾小球硬化，从而加重肾脏损害^[18]。本研究多因素一般Logistic回归分析显示PAI-1基因型多态性、透析龄、LDL-C是影响DN患者并发脑梗死的因素，提示并印证PAI-1基因型多态性、透析龄、LDL-C与DN患者并发脑梗死有关，PAI-1基因检测联合透析龄、LDL-C等临床指标，可为DN患者制订分层管理策略提供依据。DN透析龄长者长期积累代谢产物，血液中高磷、高钙等异常代谢产物可导致血管内皮损伤和炎症反应，促进动脉粥样硬化的形成，增加脑梗死发生风险。LDL-C水平高可引起动脉内脂质沉积，形成动脉粥样硬化斑块，这些斑块堆积在血管壁上，逐渐增大、硬化和破裂，导致血管狭窄和阻塞，最终引发脑梗死；高水平的LDL-C在血管壁内沉积会引发炎症反应，炎症反应使斑块变得不稳定，增加其破裂的风险，斑块破裂可使血液中的血小板和其他凝血因子聚集在破裂处，形成血栓，进一步堵塞血管，增加脑梗死发生风险。LEE等^[19]研究显示，降低LDL-C水平可降低脑血管意外风险。KHAN等^[20]研究显示，LDL-C < 70 mg/dL可降低主要心脑血管事件发生风险和病死率。

PAI-1位于人类第七染色体（7q21.3-22）上，PAI-1是组织纤溶酶原激活剂和尿激酶的主要抑制剂，主要功能是将纤溶酶原转化为纤溶酶，纤维蛋白溶解是纤维蛋白降解的重要过程，主要受PAI-1调节，纤维蛋白溶解是保持血管通畅并降解细胞外基质的重要物质^[21]。特定的单核苷酸多态性与脑卒中和其他疾病的风险相关，启动子是调节基因表达的重要遗传区域之一，且启动子包含功能相关的多态性位点，PAI-1启动子区域中常见的rs1799889“4G”等位基因与PAI-1转录增加有关，被认为是抑制纤溶酶原激活的独立标志物，PAI-1基因遗传多态性启动子-675位的4G >5G，4G等位基因增加可增加启动子活性和mRNA表达，影响血浆中PAI-1水平，进而影响纤溶酶系统的平衡及血栓形成和溶解过程，增加血栓形成风险，从而促进脑梗死发生。胡常晖等^[22]研究显示，PAI-1基因4G/5G位点的4G/4G基因型均与老年慢性肾衰竭的发生相关。CHOI等^[23]研究显示，PAI-1基因-675 4G>5G与脑卒中患病率有关。DAYCO等^[24]研究显示，PAI-1基因4G/5G多态性与复发性缺血性脑卒中有关，4G/4G基因型缺血性脑卒中发生风险高。MAHMUTBEGOVIC等^[25]研究显示，PAI-1基因4G/4G基因型和4G等位基因频率过度表达与脑卒中有关。ROC曲线结果显示，透析龄、LDL-C、PAI-1基因多态性单一及联合预测DN患者并发脑梗死的敏感性分别为77.78%、87.65%、85.19%、92.59%，特异性分别为75.00%、70.59%、67.65%、85.29%，曲线下面积分别为0.810、0.853、0.764、0.939，表明基于PAI-1基因多态性对DN患者并发脑梗死的预测效能良好。

综上所述，PAI-1基因4G/4G基因型、透析龄、LDL-C与DN患者并发脑梗死有关，三者联合预测DN患者并发脑梗死的效能良好。PAI-1基因位点多态性与DN患者并发脑梗死的关系尚未完善阐明，其病理机制仍需后续研究进一步证实。此外单个基因影响有限，后续仍需收集更多的样本量，并扩大SNP位点数量进行更深入研究。

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基金资助

黑龙江省卫生健康委科研课题(20230303050025)