氧化三甲胺对血管内皮细胞线粒体功能的作用研究

Effect of trimethylamine-N-oxide on mitochondrial function of vascular endothelial cells

摘要

目的 探讨氧化三甲胺（TMAO）对血管内皮细胞线粒体功能的影响。 方法 使用不同浓度的TMAO（50、100和150 mmol/L）刺激人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）24 h，或使用100 mmol/L浓度的TMAO干预HUVEC不同的时间（12、24和36 h）。利用CCK-8法检测HUVEC的细胞活力；采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平；使用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液内皮素-1（ET-1）、白细胞介素-18（IL-18）、IL-1β、IL-6和IL-10水平；采用罗丹明-123探针检测线粒体膜电位（MMP）；采用MitoSOX Red探针检测线粒体活性氧（mtROS）；使用Calcein AM染色检测线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放程度。 结果 TMAO浓度自50 mmol/L开始，细胞活力开始降低，且呈剂量依赖性变化（P <0.05）。TMAO干预12 h后，细胞活力显著降低，且呈时间依赖性变化（P <0.05）。不同浓度TMAO组细胞凋亡率均高于对照组（P <0.05）。对照组ET-1水平低于不同浓度TMAO组（P <0.05）。对照组IL-18、IL-1β、IL-6水平均低于不同浓度TMAO组（P <0.05），IL-10水平高于不同浓度TMAO组（P <0.05）。不同浓度TMAO组罗丹明-123相对表达量均低于对照组（P <0.05）。TMAO处理24、36 h组罗丹明-123相对表达量均低于对照组（P <0.05）。100、150 mmol/L TMAO组MitoSOX相对表达量均高于对照组（P <0.05）。不同干预时间TMAO组MitoSOX相对表达量均高于对照组（P <0.05）。不同浓度TMAO组Calcein AM相对表达量均低于对照组（P <0.05）。不同干预时间TMAO组Calcein AM相对表达量均低于对照组（P <0.05）。 结论 TMAO可诱导内皮细胞线粒体功能障碍。

Abstract

Objective To explore the effect of trimethylamine-N-oxide (TMAO) on mitochondrial function of vascular endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were either stimulated with varying concentrations of TMAO (50, 100, and 150 mmol/L) for 24 hours or treated with 100 mmol/L TMAO for 12, 24, and 36 hours. Cell viability was assessed using the CCK-8 assay. Apoptosis levels were measured by Annexin V-FITC/PI double staining. Levels of endothelin-1 (ET-1), interleukin-18 (IL-18), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), and interleukin-10 (IL-10) in cell culture supernatants were quantified via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Mitochondrial membrane potential (MMP) was detected using a rhodamine-123 probe. Mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) were measured with a MitoSOX Red probe. The degree of mitochondrial permeability transition pore (MPTP) opening was evaluated by Calcein AM staining. Results Cell viability decreased in a dose-dependent manner starting at TMAO concentrations of 50 mmol/L (P < 0.05). After 12 hours of TMAO exposure, cell viability significantly decreased in a time-dependent manner (P < 0.05). The cell viability in TMAO-treated groups was higher than that in the control group across all concentrations (P <0.05). ET-1 levels in the control group were lower than those in TMAO-treated groups at different TMAO concentrations (P < 0.05). IL-18, IL-1β, and IL-6 levels in the control group were lower than those in TMAO-treated groups at different TMAO concentrations (P < 0.05), while IL-10 levels were higher in the control group than in TMAO-treated groups (P < 0.05). The relative expression of rhodamine-123 in TMAO-treated groups at different concentrations was lower than that in the control group (P < 0.05). The relative expression of rhodamine-123 in the 24- and 36-hour TMAO-treated groups was lower than that in the control group (P < 0.05). The relative expression of MitoSOX in the 100- and 150-mmol/L TMAO-treated groups was higher than that in the control group (P < 0.05). The relative expression of MitoSOX in TMAO-treated groups at different intervention times was higher than that in the control group (P < 0.05). The relative expression of Calcein AM in TMAO-treated groups at different TMAO concentrations was lower than that in the control group (P < 0.05). At different intervention times, the relative expression of Calcein AM in TMAO-treated groups was lower than that in the control group (P < 0.05). Conclusions TMAO induces mitochondrial dysfunction in vascular endothelial cells.

Graphical abstract

关键词

动脉粥样硬化 / 氧化三甲胺 / 内皮细胞 / 线粒体功能障碍

Key words

atherosclerosis / trimethylamine-N-oxide / endothelial cell / mitochondrial dysfunction

动脉粥样硬化是大多数心血管疾病的主要病理基础，其是炎症细胞和脂质聚集于血管壁的一种慢性炎症性疾病。血管内皮细胞的炎症损伤是动脉粥样硬化形成的初始环节^[1]。线粒体是细胞内的能量中心，能够维持细胞稳态，参与细胞增殖、细胞凋亡和氧化应激等细胞生理过程。线粒体通过自噬、融合和分裂等过程进行线粒体的质量控制以维持细胞稳态。当线粒体DNA发生突变或线粒体融合、分裂和自噬发生异常时，线粒体功能受损。线粒体功能损伤主要表现为线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）下降、腺苷三磷酸缺乏、活性氧（reactive oxygen species, ROS）增多、线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）开放和线粒体形态异常。血管内皮细胞线粒体功能障碍能够导致内皮细胞损伤，进而引起氧化应激、炎症反应、细胞衰老及凋亡等，最终发生动脉粥样硬化^[2-3]。

氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide, TMAO）是胆碱和L-肉碱经肠道菌群代谢生成的衍生物，与心血管疾病密切相关^[4-5]。近年来，TMAO被认为是促进动脉粥样硬化斑块病变起始和进展的重要危险因素^[6-7]。在动物研究中发现，在膳食补充胆碱的小鼠机体中，高浓度的TMAO水平可加重小鼠动脉粥样硬化斑块的病变^[8-9]。临床研究发现心血管疾病患者的血浆TMAO水平高于健康人群，血浆高浓度的TMAO水平能够预测心血管疾病的发生风险^[10]。

TMAO可通过多种机制参与动脉粥样硬化，包括诱导内皮细胞功能障碍，促进泡沫细胞形成，增加血小板反应性和诱发炎症反应^[11-13]。其中，TMAO与血管内皮细胞的关系受到了广泛关注。TMAO可通过减少一氧化氮合成，增强氧化应激，诱发内皮细胞炎症反应，最终导致内皮细胞功能障碍^[14]。CHEN等^[15]发现TMAO可通过上调细胞内ROS产生，促进内皮细胞线粒体自噬，最终导致内皮细胞损伤，发生细胞焦亡。近年研究已明确TMAO可通过介导血管内皮细胞损伤导致动脉粥样硬化。但是，关于TMAO促进内皮细胞损伤的机制尚未完全明确，并且关于TMAO对内皮细胞损伤线粒体功能影响的相关研究仍罕见。因此，本研究通过体外培养人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC），探索TMAO促进动脉粥样硬化的机制，以及TMAO对内皮细胞线粒体功能的影响。

1 材料与方法

1.1　材料与试剂

HUVEC（中国科学院细胞库，货号：GNHu23），胎牛血清（德国PAN公司，货号：P30-3306），TMAO（美国Sigma公司，货号：317594），CCK-8试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0218），酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒：内皮素-1（Endothelin-1, ET-1）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、IL-10、IL-18和IL-1β（上海酶联生物科技有限公司，货号：YJ24645、YJ058097、YJ064299、YJ22798、YJ22795），罗丹明-123（美国Sigma公司，货号：R8004），线粒体超氧化物检测试剂盒、线粒体通透性转换孔检测试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：S0061S、C2009S、C1062M）。

1.2　仪器与设备

二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher公司），多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司），NovoCyte^TM流式细胞仪（杭州艾森生物有限公司），倒置荧光显微镜（德国Leica公司），激光共聚焦显微镜（日本Olympus株式会社）。

1.3　方法

1.3.1　TMAO溶液制备

称取0.15 g TMAO粉末，并使用1.99 mL PBS缓冲液充分溶解，配制成1 000 mmol/L的TMAO母液，过滤除菌后分装，-20 ℃保存。

1.3.2　HUVEC培养及分组

细胞复苏后，在25 mL细胞培养瓶中用含12%胎牛血清，1%双抗的DMEM培养基培养，培养条件为37 ℃、饱和湿度、5%二氧化碳和95%空气。①按照TMAO的不同浓度分组。对照组：完全培养基培养，不进行任何处理的HUVEC。实验组：完全培养基培养，不同浓度的TMAO（50、100和150 mmol/L）处理24 h的HUVEC。②按照TMAO的不同作用时间分组。对照组：完全培养基培养，不进行任何处理的HUVEC。实验组：完全培养基培养，100 mmol/L的TMAO处理不同时间（12、24和36 h）HUVEC。

1.3.3　CCK-8检测细胞增殖

将HUVEC以1×10⁴个/孔的细胞密度接种到96孔板中，细胞培养24 h后，进行TMAO（10、25、50、100、150、200、250、300 mmol/L）干预24 h，然后用100 mmol/L的TMAO干预12、24和36 h。细胞处理完毕后，吸除孔内液体，每孔加入含10% CCK-8培养基100 μL，37 ℃细胞培养箱中孵育1 h。多功能酶标仪测定450 nm波长处的光密度（optical density, OD）值，计算细胞存活率。

1.3.4　Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

将HUVEC以2.5×10⁵个/孔的细胞密度接种于6孔板，24 h后进行TMAO干预。胰酶消化后收集细胞，以1 000 r/min离心5 min。加入1 mL PBS，重悬细胞后离心5 min，弃上清液。每管分别加入100 μL稀释的1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞。加入2.5 μL Annexin V-FITC和2.5 μL PI-PE，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15～20 min。再加入400 μL稀释的1×Annexin V Binding Buffer，混匀样本，立即上机检测。

1.3.5　ELISA检测细胞上清液ET-1、IL-6、IL-10、IL-18和IL-1β水平

将HUVEC以1×10⁴个/孔的细胞密度接种到96孔板中，细胞培养24 h后，进行TMAO干预。细胞处理完毕后，吸取50 μL不同浓度的标准品加入标准品孔，样本孔中先加入10 μL样本，再添加40 μL样本稀释液，空白孔不加。除空白孔外，在标准品孔和样本孔中均加入酶标抗体100 μL，随后37 ℃恒温箱中避光孵育60 min。孵育结束后，重复洗板5次，拍干。所有孔中依次加入50 μL的底物A、B，在37 ℃恒温箱中避光15 min后，所有孔中加入50 μL终止液。立即使用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的OD值。

1.3.6　MMP检测

称取罗丹明-123粉末1 mg，用262 μL DMSO溶解，配制成10 mmol/L的储备液。再使用无血清培养基将储备液稀释至10 μmol/L，制备染色工作液。将HUVEC以2.5×10⁵个/孔的细胞密度接种到6孔板中，24 h后进行TMAO干预。细胞处理完毕后，吸去培养液，PBS清洗1遍。每孔加入1 000 μL染色工作液，37 ℃细胞培养箱中孵育40 min。孵育完毕后弃去染色液，PBS清洗2遍，加入1 000 μL无血清培养基，荧光显微镜下观察。

1.3.7　线粒体活性氧（mitochondrial ROS, mtROS）检测

将处于对数生长期的HUVEC细胞以8×10³个/孔的密度接种到96孔板中，24 h后进行TMAO干预。将1 μL MitoSOX Red加入2 500 μL PBS中，稀释为 2 μmol/L的染色工作液。细胞处理完毕后，吸去细胞培养液，PBS清洗1遍。每孔加入100 μL染色工作液，37 ℃细胞培养箱孵育30 min。孵育完毕后弃去染色液，每孔加入100 μL PBS清洗2遍，再加入适量PBS，荧光显微镜下观察。

1.3.8　MPTP检测

将对数生长期的HUVEC细胞以1×10⁵个/皿的密度接种至20 mm激光共聚焦培养皿中，24 h后进行TMAO干预。将1 μL Calcein AM加入1 000 μL无血清培养基中配制染色工作液。再将10 μL氯化钴加入1 000 μL染色液中配制荧光淬灭工作液。细胞处理完毕后，吸去细胞培养液，PBS清洗1遍。培养皿中加入染色工作液或荧光淬灭工作液1 000 μL，37 ℃细胞培养箱中孵育30 min。孵育完毕后吸去染色液，每皿加入37 ℃预热的无血清细胞培养液1 000 μL，37 ℃细胞培养箱中孵育30 min。孵育结束后，吸去培养液，加入适量检测缓冲液，激光共聚焦显微镜下观察。

1.4　统计学方法

数据处理采用GraphPad Prism 9.0统计软件。计量资料以均数±标准差（$\bar{x} \pm s$）表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较用Tukey HSD检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　TMAO对HUVEC细胞活力的影响

对照组和10、25、50、100、150、200、250、300 mmol/L TMAO组的细胞相对活力分别为（1.00±0.06）、（1.00±0.08）、（0.93±0.08）、（0.88±0.04）、（0.80±0.03）、（0.73±0.03）、（0.66±0.05）、（0.53±0.05）、（0.46±0.06），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =79.555，P =0.000）；组间两两比较，差异均有统计学意义（P <0.05）。结果显示TMAO浓度自50 mmol/L开始，细胞活力开始降低，且呈剂量依赖性变化（P <0.05）。见图1。

对照组和TMAO处理12、24、36 h组的细胞相对活力分别为（1.00±0.06）、（0.88±0.05）、（0.80±0.03）、（0.77±0.04），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =36.178，P =0.000）；组间两两比较，差异均有统计学意义（P <0.05）。结果显示TMAO干预12 h后，细胞活力降低，且呈时间依赖性变化（P <0.05）。见图2。

2.2　TMAO对HUVEC凋亡率的影响

对照组和50、100、150 mmol/L TMAO组的细胞凋亡率分别为（3.46±0.06）%、（9.45±0.85）%、（14.97±1.77）%、（19.78±2.98）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =46.778，P =0.000）。不同浓度TMAO组均高于对照组（P <0.05）。提示TMAO可诱导内皮细胞凋亡。见图3。

2.3　TMAO对HUVEC分泌ET-1能力的影响

对照组和50、100、150 mmol/L TMAO组的ET-1水平分别为（556.64\pm37.99）%、（658.66\pm15.61）%、（684.42\pm54.32）%、（658.91\pm25.06）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =7.314，P =0.011），对照组ET-1水平低于不同浓度TMAO组（P <0.05）。提示TMAO具有导致内皮细胞损伤的作用。

2.4　TMAO对HUVEC炎症反应的影响

各组IL-18、IL-1β、IL-6、IL-10水平比较，经单因素方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05），对照组IL-18、IL-1β、IL-6水平均低于不同浓度TMAO组（P <0.05），IL-10水平高于不同浓度TMAO组（P <0.05）。结果提示TMAO具有促进内皮细胞炎症反应的作用。见表1。

2.5　TMAO对HUVEC中MMP的影响

对照组和50、100、150 mmol/L TMAO组的罗丹明-123相对表达量分别为（1.00±0.14）、（0.67±0.15）、（0.43±0.07）、（0.32±0.01），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =23.816，P =0.000）。不同浓度TMAO组罗丹明-123相对表达量均低于对照组（P <0.05）。TMAO处理12、24、36 h组的罗丹明-123相对表达量分别为（1.00±0.10）、（0.89±0.08）、（0.53±0.00）、（0.52±0.08），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =30.794，P =0.000）。TMAO处理24、36 h组罗丹明-123相对表达量均低于对照组（P <0.05）。结果表明在TMAO的作用下，线粒体功能受损使MMP发生去极化，导致MMP降低。见图4。

2.6　TMAO对HUVEC中mtROS的影响

对照组和50、100、150 mmol/L TMAO组的MitoSOX相对表达量分别为（1.00±0.01）、（1.28±0.06）、（2.00±0.15）、（2.20±0.23），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =51.576，P =0.000），100、150 mmol/L TMAO组MitoSOX相对表达量均高于对照组（P <0.05）。对照组和TMAO处理12、24、36 h组的MitoSOX相对表达量分别为（1.00±0.01）、（1.74±0.13）、（2.12±0.09）、（2.22±0.19），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =61.812，P =0.000），不同干预时间TMAO组MitoSOX相对表达量均高于对照组（P <0.05）。结果表明TMAO可诱导HUVEC的线粒体中mtROS积聚，引起氧化应激，导致线粒体功能障碍。见图5。

2.7　TMAO对HUVEC中MPTP的影响

对照组和50、100、150 mmol/L TMAO组的Calcein AM相对表达量分别为（1.00±0.08）、（0.38±0.05）、（0.25±0.02）、（0.13±0.03），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =320.748，P =0.000），不同浓度TMAO组Calcein AM相对表达量均低于对照组（P <0.05）。对照组和TMAO处理12、24、36 h组的Calcein AM相对表达量分别为（1.00±0.10）、（0.34±0.02）、（0.28±0.03）、（0.29±0.06），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F =161.153，P =0.000），不同干预时间TMAO组Calcein AM相对表达量均低于对照组（P <0.05）。结果表明TMAO可导致HUVEC中的MPTP的开放程度增加。见图6。

3 讨论

内皮细胞损伤主要表现为细胞发生氧化应激，细胞活力、增殖和迁移能力降低，发生凋亡和炎症反应^[16-17]。本研究发现TMAO可降低HUVEC的细胞活力，诱导凋亡，分泌过量ET-1和炎症因子。ET-1是由血管内皮细胞分泌的具有收缩功能的血管活性肽。内皮细胞损伤后，其分泌的ET-1水平升高，导致血管功能障碍。本研究结果发现，TMAO可促进HUVEC分泌大量的ET-1，说明TMAO导致了内皮细胞的损伤。损伤的内皮细胞可释放大量炎症因子，导致细胞内发生炎症反应。本研究结果显示，TMAO使HUVEC分泌IL-6、IL-18和IL-1β水平升高，IL-10水平降低，说明TMAO可促使细胞内促炎细胞因子的表达增加，抑炎细胞因子的表达降低，导致细胞内免疫失衡，引起内皮细胞炎症反应。

线粒体是一种高度动态的细胞器，其通过自噬、融合和分裂等方式调控线粒体质量，从而调节线粒体的形态、数量、大小和细胞命运^[18-19]。线粒体损伤的早期特征是MMP下降，随后导致mtROS生成增多^[20]。本研究结果显示经TMAO处理的HUVEC的MMP显著降低，且呈剂量依赖性和时间依赖性递减，并伴随mtROS表达增加，表明TMAO可诱导MMP下降，发生线粒体去极化，mtROS产生增多，导致线粒体功能障碍。mtROS作为许多信号通路的重要细胞信使，对调节基因表达、信号传导和应激等细胞反应至关重要^[21]。先前研究发现TMAO可诱导mtROS生成增加，并通过沉默蛋白3/超氧化物歧化酶2/mtROS信号通路激活NOD样受体蛋白3炎症小体，引起血管炎症^[22]，与本研究结果一致。本研究也发现经TMAO处理的HUVEC中的mtROS表达增加，且呈剂量依赖性和时间依赖性递增。过量的ROS可激活GTP酶动力相关蛋白1的活性，进而破坏线粒体动力学，促进线粒体去极化，并加速内皮细胞中的线粒体损伤^[23]。因此，本研究结果表明TMAO可能通过上调mtROS的表达，促进线粒体损伤，诱发细胞内氧化应激，最终导致血管内皮细胞功能障碍。MPTP是线粒体内外进行物质转运的通道。当细胞发生凋亡或死亡时，MPTP开放，线粒体通透性发生改变，引起钙离子过载，细胞内ROS水平升高，MMP下降或消失^[24]。同时，钙离子过载、mtROS产生增加及MMP消失也会诱导MPTP的持续激活^[25]。本研究发现TMAO可增加MPTP的开放程度，且呈剂量依赖性改变。该结果表明TMAO可能通过促进内皮细胞中大量线粒体的MPTP持续性开放，导致MMP降低或消失和mtROS产生过量，引起线粒体功能障碍。经TMAO介导产生的过量mtROS又可进一步激活MPTP，从而加剧了MMP的下降，引起氧化应激和线粒体损伤。

同时，本研究有一定的局限性。首先，本研究仅进行了线粒体功能的检测，没有利用电子显微镜对线粒体形态及微观结构进行观察。其次，本研究仅探讨了TMAO对内皮细胞线粒体功能的影响，没有深入探索TMAO致线粒体功能障碍的机制。今后需进一步探究TMAO与线粒体分裂、融合和自噬的关系。

综上所述，TMAO可通过诱导内皮细胞线粒体功能障碍进而引起血管内皮细胞损伤，随后发生内皮细胞活力减低、凋亡和炎症反应。这一结论不仅丰富了动脉粥样硬化的理论知识，也为TMAO诱导内皮细胞功能障碍这一机制提供了更深入的见解。TMAO有望成为未来治疗动脉粥样硬化的新靶点，通过调整饮食结构，减少机体TMAO生成和保护血管内皮也许是治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的有效方法。

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基金资助

内蒙古自治区自然科学基金(2023LHMS08065)