内含子源性27nt-microRNA对大鼠血管平滑肌细胞表型转换的影响及其机制研究

摘要

目的 探讨内含子源性27nt-miRNA(27nt-miR)对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）表型转换的影响及其分子机制。方法 用27nt-miR表达慢病毒转染培养的VSMCs，观察其对PDGF-BB诱导的VSMCs表型转换的影响；将细胞分为对照组、PDGF-BB诱导组、27ntmiR组、27nt-miR-sponge组及27nt-miR NC组（27nt-miR NC组）。雷帕霉素（100 nmol/L）与MHY-1485(10μmol/L)作用于27nt-miR组、27nt-miR-sponge组及27nt-miR NC组，以验证27nt-miR是否参与mTOR与p70S6k通路的调控。用生物信息学预测27nt-miR与mTOR的靶向结合位点，用CCK-8法与EdU法分别测定VSMCs活力与增殖情况，划痕试验测定VSMCs迁移能力，实时荧光聚合酶链反应检测α-SMA、SM22α及OPN mRNA表达，Western blotting检测α-SMA、SM22α、OPN、mTOR、p-mTOR、p70S6k与pp70S6k蛋白表达。结果 CCK-8法结果示，PDGF-BB诱导组细胞增殖率较正常值高（P <0.05）,27ntmiR NC组与PDGF-BB诱导组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;27nt-miR组细胞增殖率较27nt-miR NC组低（P <0.05）,27nt-miR-sponge组与27nt-miR NC组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。PDGFBB诱导组细胞迁移率较对照组高（P <0.05）,27nt-miR NC组与PDGF-BB诱导组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;27nt-miR组细胞迁移率较27nt-miR NC组低（P <0.05）,27nt-miR-sponge组细胞迁移率与27nt-miR NC组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。EdU法结果示，PDGF-BB诱导组细胞增殖率较对照组高（P <0.05）,27nt-miR NC组与PDGF-BB诱导组细胞增殖率比较，差异无统计学意义（P>0.05）;27nt-miR组细胞增殖率较27nt-miR NC组低（P <0.05）,27nt-miR-sponge组与27nt-miR NC组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。PDGF-BB诱导组α-SMA mRNA相对表达量较对照组低（P <0.05），两组SM22α与OPN mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。27nt-miR NC组与PDGF-BB诱导组α-SMA、SM22α、OPN mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）;27nt-miR组α-SMA、SM22α mRNA相对表达量较27nt-miR NC组高（P <0.05）,OPN mRNA相对表达量较27nt-miR NC组低（P <0.05）;27nt-miR-sponge组与27nt-miR NC组α-SMA、SM22α mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）,27nt-miR-sponge组OPNm RNA相对表达量较27nt-miRNC组高（P<0.05）。PDGF-BB诱导组α-SMA、SM22α蛋白相对表达量较对照组低（P <0.05）;27nt-miR NC组、PDGF-BB诱导组OPN蛋白相对表达量较27nt-miR组高（P <0.05）;27nt-miR组α-SMA、SM22α蛋白相对表达量较27nt-miR NC组高（P <0.05）,OPN蛋白相对表达量较27nt-miR NC组低（P <0.05）;27nt-miR组p70S6k、p-p70S6k与p-mTOR蛋白相对表达量较27nt-miR NC组低（P <0.05）；各组经雷帕霉素处理后，27ntmiR-sponge组与27nt-miR NC组各蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P <0.05）。27nt-miR组p70S6k、p-p70S6k、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量较27nt-miR NC组低（P <0.05）,27nt-miR-sponge组与27nt-miR NC组p-p70S6k、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P <0.05）。各组经MHY-1485处理后，27nt-miR组p70S6k、p-p70S6k、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量较27ntmiR NC组低（P <0.05）;27nt-miR-sponge组与27nt-miR NC组各蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P <0.05）。结论 27nt-miR可能通过靶向m TOR/p70S6k信号通路从而调节大鼠血管平滑肌细胞增殖活力、增殖、迁移与表型转换。

关键词

27nt-microRNA / 血管平滑肌细胞 / mTOR/p70S6k信号通路 / 表型转换