牛膝醇提物通过滑膜液外泌体介导的m6A修饰抑制膝骨关节炎的分子机制研究

摘要

目的 基于滑膜液外泌体介导的m6A修饰，探讨牛膝醇提物对膝骨关节炎（KOA）的影响。方法利用改良Hulth法复制KOA大鼠模型，提取并鉴定滑膜液外泌体。通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等方法检测KOA大鼠滑膜液外泌体中m6A修饰的变化，识别差异m6A。构建滑膜炎症细胞模型，将实验分为对照组、IL-1β组、IL-1β+si-NC组、IL-1β+si-METTL3组，检测METTL3对滑膜细胞存活率及趋化因子分泌的影响。通过HE和番红固绿染色评估METTL3对KOA滑膜退变的组织学影响。使用Nanosight和RT-PCR检测牛膝醇提物对滑膜液外泌体的数量、活性及METTL3表达的影响。结果 KOA大鼠模型成功复制后，micro-CT显示对照组大鼠的膝关节表面光滑，关节间隙正常；而模型组大鼠的膝关节表面粗糙，关节间隙狭窄。通过Nanosight检测，外泌体颗粒丰度为76～80 nm,Western blotting检测结果显示，CD9和TSG101高表达，电子显微镜下外泌体为椭圆形，直径<200 nm。m6A定量检测结果显示，KOA模型组m6A总量、METTL3表达均高于对照组（P <0.05），去甲基化酶表达均无明显变化（P>0.05）。METTL3沉默对滑膜细胞存活率的影响检测结果显示，与IL-1β组和IL-1β+si-NC组比较，IL-1β+si-METTL3组的细胞存活率升高（P <0.05）。检测METTL3沉默对滑膜细胞趋化因子SDF-1和MCP-1分泌的影响，结果表明，与IL-1β组和IL-1β+si-NC组比较，IL-1β+si-METTL3组SDF-1和MCP-1浓度均降低（P <0.05）。HE和番红固绿染色结果显示，对照组细胞层次分明，无明显炎症浸润；模型组和Scr-RNA组细胞排列紊乱，有血管增生和炎症浸润；Sh-METTL3组炎症浸润减少，血管增生缓解。牛膝醇提物含药血清刺激实验检测滑膜细胞存活率结果显示，与模型组比较，牛膝醇提物组滑膜细胞存活率升高（P <0.05）。与METTL3过表达组比较，METTL3过表达加牛膝醇提物组滑膜细胞存活率升高（P <0.05）。动物实验中，与对照组比较，牛膝醇提物组外泌体数量和乙酰胆碱酯酶活性均无明显变化（P>0.05），但模型组METTL3基因相对表达量高于对照组和牛膝醇提物组（P <0.05）。结论 KOA滑膜液外泌体中METTL3高表达，能够降低滑膜细胞存活率并促进趋化因子分泌。牛膝醇提物可能通过降低外泌体中METTL3的表达缓解KOA滑膜炎症。

关键词

膝骨关节炎 / 滑膜细胞 / 牛膝醇提物 / 外泌体 / N6甲基腺苷修饰