基于免疫细胞再生障碍性贫血发病机制的研究进展

Research progress on the pathogenesis of aplastic anemia based on immune cells

摘要

再生障碍性贫血（AA）是由多因素引起的骨髓造血功能降低或衰竭的血液系统疾病。该文对近年来AA发病机制有关T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞的报道进行综述，为今后深入研究AA发病机制与新治疗靶点提供证据和思路。

Abstract

Aplastic anemia (AA) is a hematological disorder characterized by reduction or failure of bone marrow hematopoiesis caused by multiple factors. This article reviews recent reports on the pathogenesis of AA related to immune cells, including T lymphocytes, B lymphocytes, NK cells, dendritic cells, and macrophages. It provides evidence and perspectives for further research on the pathogenesis and new therapeutic targets of AA.

关键词

再生障碍性贫血 / 免疫细胞 / 发病机制 / T淋巴细胞

Key words

aplastic anemia / immune cells / pathogenesis / T lymphocytes

再生障碍性贫血（aplastic anemia, AA）是多因素造成骨髓造血功能降低或衰竭，导致全血细胞减少的血液系统疾病。骨髓作为造血系统的重要组成部位之一，主要由3个要素构成，即造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells, HSPCs）、造血微环境及造血调节相关因子。AA经典发病机制将此3个要素分别比喻为“种子”“土壤”和“虫子”。“种子学说”强调HSPCs数量的减少和质量下降进一步导致AA骨髓总体集落形成能力降低；“土壤学说”注重与HSPCs紧密联系、为之提供营养的骨髓造血微环境；“虫子学说”阐释免疫异常可损伤HSPCs，其中，细胞免疫和体液免疫起主导作用。“虫子学说”出现在20世纪70年代，抗淋巴细胞球蛋白和抗胸腺细胞球蛋白的使用让重型AA（severe aplastic anemia, SAA）患者得到缓解，这充分证明了机体的免疫是阻碍骨髓造血的关键，免疫异常是AA的病因之一。目前，环孢菌素A、丙种球蛋白、糖皮质激素等免疫调节药物治疗AA具有良好的临床疗效^[1]，再次诠释了骨髓造血障碍的主要机制之一是免疫介导的造血抑制。

1 T淋巴细胞

T细胞免疫与造血功能衰竭密切相关。既往研究发现，利用单细胞RNA测序，谱系定向祖细胞的选择性抑制加上可变剪接和多聚腺苷酸化的缺陷，可引起HSPCs功能障碍，T细胞可能会错误地将HSPCs识别成持续病毒感染相关的抗原，导致AA患者的HSPCs被T细胞介导消除^[2]。

1.1　CD8⁺T细胞

T细胞免疫异常大多集中在CD8⁺T细胞。张强等^[3]回顾性分析88例AA患者与健康人群的外周血T淋巴细胞亚群，结果提示AA患者的CD8⁺T细胞数量较健康人群增多。REN等^[4]实验证明，表达CX3C趋化因子受体1（chemokine C-X3-C-motif receptor 1, CXC3R1）的CD3⁺T细胞数量显著增加，且CXC3CR1可协助AA的T细胞迁移到骨髓中，进一步介导CD8⁺T细胞增加。

CD8⁺T细胞经双信号活化后成为细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）。基因转录紊乱、与T细胞受体（T cell receptor, TCR）信号传导相关microRNA异常表达、组蛋白乙酰化增加、T细胞激活链接蛋白表达、与CXC3R1相关的其他因素等原因，均可异常激活CTL，抑制自体及异体祖细胞集落形成，进而导致HSPCs耗竭。SAA患者外周血中，穿孔素和颗粒酶B基因的mRNA水平显著上升。穿孔素和颗粒酶是CTL的主要细胞毒素，两者进入造血细胞内，能直接崩解靶细胞，或激活凋亡相关酶的级联反应，从而引发靶细胞凋亡。此外，CTL还可通过膜分子和细胞因子杀伤造血细胞：造血细胞表面的死亡受体Fas与CTL表面Fas配体（fas ligand, FasL）结合后，能激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase），最终诱导造血细胞凋亡^[5]。

CD8⁺T细胞可分泌肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α、TNF-β、干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）、白细胞介素（Interleukin, IL）等细胞因子。其中，TNF与HSPCs表面的肿瘤坏死因子受体Ⅰ（tumor necrosis factor receptor Ⅰ, TNFRⅠ）结合，与FasL/Fas途径类似，激活Caspase并诱导造血细胞凋亡^[6]。IFN-γ则能激活巨噬细胞，诱导感染细胞表达主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex, MHC）分子，从而提高HSPCs对CTL攻击的敏感性，使其更容易遭受破坏。过度表达的IFN-γ和TNF-α上调造血细胞表面的IFN受体、TNF受体并与之结合，阻断细胞周期，诱导一氧化氮合成酶活化，产生一氧化氮。一氧化氮具有细胞毒性，会进一步加剧造血细胞凋亡、抑制造血功能^[7]。此外，IL亦有协同杀伤造血细胞的功能，特别是IL-2，其可由辅助性T细胞1（helper T lymphocyte 1, Th1）分泌产生，不仅促进T细胞增殖和分化，还能刺激更多促炎因子的产生^[8]。

信号淋巴细胞活化分子家族6（SLAM family member 6, SLAMF6）仅在免疫细胞表面表达。一项实验表明，在SAA患者的CD8⁺T淋巴细胞中，SLAMF6的表达水平显著低于健康人，且其表达水平与CD8⁺T细胞的穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ的表达呈负相关^[9]。这说明SLAMF6具有调控CD8⁺T细胞的功能，其是调节SAA患者CD8⁺T淋巴细胞稳态的潜在靶点。

综上所述，CD8⁺T细胞免疫异常的发病机制大致可归结为以下3个方面：首先，抗原呈递细胞（antigen-presenting cells, APCs）将抗原同时提呈给CD8⁺T细胞和Th1细胞并诱导两者活化。活化后的CD8⁺T细胞转变为CTL，通过其自身细胞毒素直接杀伤造血细胞。其次，活化后的CD8⁺T细胞释放并提高IFN-γ、TNF-α等细胞因子及一氧化氮的表达，诱导造血细胞死亡间接抑制造血功能。最后，活化的Th1细胞亦分泌大量IL-2，进一步促进CD8⁺T细胞增殖及相关造血负调控因子的分泌，最终导致造血细胞凋亡和骨髓造血功能衰竭。或许，这一发病机制也是免疫抑制治疗（immunosuppressive therapy, IST）在AA治疗中发挥作用的原因。

1.2　CD4⁺T细胞

CD4⁺T细胞通过产生细胞因子和趋化因子来协调免疫反应，从而在免疫保护中发挥核心作用。在接受抗原提呈后，CD4⁺T细胞可分化为Th和调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）。深入研究AA和CD4⁺T细胞后发现，CD4⁺T细胞中亚群失衡、功能亢进及细胞因子异常活化，均可导致骨髓损伤并阻碍造血，这也是诱导AA发病的原因之一。

1.2.1　Th1、Th2

Th1和Th2均由CD4⁺T细胞分化而来，其不同的功能和特点在免疫应答中起着关键作用。Th1主要参与细胞免疫应答，分泌细胞因子如IFN-γ、IL-2、TNF-β等；Th2主要参与体液免疫应答，分泌细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等。慢性AA患者的Th1细胞数量增加且Th1/Th2细胞比例上升。激活的Th1状态可引起免疫系统对骨髓的过度攻击，这既能直接抑制造血细胞的增殖与分化，又能间接损伤骨髓微环境，进一步加剧造血衰竭。比例升高的Th1会释放大量的IFN-γ和TNF-α，一方面，这些细胞因子对造血细胞有细胞毒作用，另一方面这些细胞因子还可激活CD8⁺T细胞，使其进一步释放更多的IFN-γ、TNF-α等造血负调控因子，最终裂解CD34⁺细胞并抑制其造血集落形成^[10]。GIANNAKOULAS等^[11]发现，未经治疗或难治AA患者Th1水平较高，且其分泌的IFN-γ和IL-2也呈高表达，而Th2水平与对照组比较无差异；缓解期患者Th1细胞数量增加，Th2细胞也呈平行上升趋势。王明良等^[12]将IFN-γ和IL-4分别选作Th1和Th2的代表性细胞因子，通过检测AA患者外周血发现，Th1水平明显升高，Th2水平基本正常。因此，他们认为Thl／Th2比例失衡是导致AA造血衰竭的一个重要原因。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）属于MHC-Ⅱ分子家族，一项研究发现，未治疗的SAA树突状细胞（dendritic cell, DC）中HLA-QD链的表达高于健康人和缓解的SAA，同时，Th1及其相关因子（如IL-2、IFN-γ、TNF-α）也显著增加，而Th2及其相关因子（如IL-4）则无变化。HLA-DQ可能通过调控Th1介导的炎症通路，导致Th1/Th2失衡^[13]。

1.2.2　Tregs、Th17

Tregs是一个具有免疫调节功能的T细胞亚群，其可抑制T细胞增殖、细胞因子及自身抗体的产生，并有调节DC、单核巨噬细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）的功能，在维持免疫稳态中起重要作用^[14]。在AA患者外周血中，Tregs数量的减少、功能受到抑制，这些导致免疫系统缺乏有效的负反馈调节，因此，促炎T细胞（如Th1、Th17）数量逐渐增多、活性过度增强。齐薇薇等^[15]发现，与健康人相比，SAA患者的外周血中Tregs数量较少、占比较低，经IST后，Tregs数量有所上升。Tregs数量和功能与AA的严重程度密切相关，未知抗原可能刺激了Th1的扩增，炎症环境介导Tregs细胞的功能障碍，Tregs数量的减少、活性的抑制会推动CD4⁺T细胞向Th1分化。该进程不仅会增加Ⅰ型淋巴因子的分泌，还会过度活化CD8⁺T细胞，进而上调CTL，最终导致造血细胞损伤。此外，由于Tregs中信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription, STAT）5的磷酸化不足，抑制了转录因子BLIMP-1的表达，从而降低AA中Tregs的比例^[16]。IL-2在Tregs的发育、募集和功能中发挥关键作用。体外实验显示，低剂量的IL-2能优先诱导Tregs中STAT5的磷酸化，从而促进其扩增^[17]。

Th17细胞是主要表达IL-17的新型CD4⁺T细胞，具有促进炎症和免疫反应的作用，其分泌IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23等细胞因子，视黄酸受体相关孤儿受体γt（retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma t, RORγt）是其转录调节因子。IL-17A是一种致炎因子，能诱导巨噬细胞分泌高水平的IL6、TNF-α等造血负调控因子。研究发现，AA患者的外周血中，Th17比例明显升高，且RORγt和STAT3表达也随之增加^[18]。这是由于Thl7细胞自身分泌的IL-21通过STAT3上调RORγt表达，进而诱导CD4⁺T细胞向Thl7细胞分化。IL-23起到促进Th17细胞存活和扩增的作用，其在AA患者中的表达水平显著升高，这也是导致Th17细胞异常增殖的关键因素之一。随着Th17细胞数量的增多、促炎环境加剧，骨髓微环境中的HSPCs进一步受损。信号淋巴细胞活化分子（signaling lymphocytic activation molecule, SLAM）是T细胞及其他免疫细胞表面的跨膜共受体，与SLAM相关结合蛋白（SLAM-associated protein, SAP）相互作用，参与调控T细胞的激活和抗原诱导反应^[19]。当SLAM-SAP信号增强时，会增加IL-17分泌进而促进Th17分化，同时会导致中枢和外周B细胞耐受性受损，使得更多的自反应性B细胞能够存活并扩散。

正常情况下，Th17与Tregs细胞在免疫系统中维持平衡，Tregs负责调控过度的免疫反应，以防止自身免疫疾病的发生^[20]。然而，在AA中，Tregs功能受到抑制，Th17细胞比例增加，导致免疫失衡，加剧骨髓损伤，影响造血功能。

1.3　记忆性T细胞

记忆性T细胞（memory T cell, Tm）是适应性免疫系统的重要组成部分，作用是确保宿主再次接触特定抗原时，能更快速地发起更强烈的免疫反应。中枢记忆性T细胞（central memory T cell, Tcm）和效应记忆性T细胞（effective memory T cell,Tem）是Tm分型中的2种亚群。激活的Tem细胞迁移到炎症周围，并迅速分泌Th1和Th2相关的细胞因子。Tm依赖特定细胞因子的信号来保持其正常发挥功能，IL-15则是CD8⁺Tm的核心驱动因素，其可使这些记忆细胞快速分泌IFN-γ和IL-2，从而增加对TCR信号的敏感性并减少对共刺激的需求。ZHENG等^[5]发现，SAA患者不仅外周血中CD8⁺Tm数量增多、CD4⁺Tm/CD8⁺Tm降低，同时还存在Tem功能亢进，具体表现为穿孔素和颗粒酶B的高表达。基于此，笔者推测，在SAA中，由于基因突变或抗原刺激，导致Tm免疫调节异常，引发Th1/Th2比例失衡及CD8⁺T细胞毒性的增强，最终导致造血功能衰竭。

2 B淋巴细胞

随着对免疫机制的深入研究及免疫治疗经验的不断总结，研究人员发现B淋巴细胞及其介导的体液免疫也参与AA发病机制中。AA患者骨髓中未成熟B细胞的比例显著升高，且表现出高凋亡活性，其抗原呈递相关基因表达显著下调，这些病理特征揭示了AA患者中B细胞功能障碍可能是疾病发病的关键环节之一^[21]。TANG等^[22]认为，AA患者中B细胞的功能障碍，特别是其在抗原呈递和T细胞活化中的功能被削弱，加剧了免疫系统的失衡。HU等^[23]进一步从实验中发现，B细胞抗原受体的VDJ基因（如IGHV3-7、IGHV3-20和IGKV1-5）在AA患者中的表达显著上调，而这些基因在健康人中几乎不表达，这提示VDJ基因表达及克隆型异常可能与AA发病机制有关。此外，AA患者的B细胞不仅增加促炎因子基因的表达，还存在表达差异的基因，这些变异的基因参与到p53信号通路、Th1和Th2细胞分化通路、B细胞受体信号通路、IL-17信号通路等多条信号通路中。在配体-受体分析中，虽然AA细胞的总数多于正常细胞，但在B细胞与其他细胞的相互作用中，AA细胞的数量反而少于正常细胞，且存在15对配体-受体对差异，该配体-受体对差异提示，在B细胞的刺激下，免疫细胞功能可能发生紊乱，进而加速骨髓造血功能的衰竭。

作为B淋巴细胞的一个亚群，调节性B细胞（regulatory B cells, Bregs）通过分泌抗炎细胞因子（如IL-10、TGF-β等）调节体内的免疫反应，并通过抑制促炎T细胞（如Th1、Th17）及CTL的活性来维持免疫稳态。CD19⁺CD24^hiCD38^hi是Bregs中研究较广的群体，其抑制CTL和Th1反应，并通过IL-10等细胞因子将CD4⁺T细胞转化为Tregs^[24]。ZAIMOKU等^[24]发现，AA患者的CD19⁺CD24^hiCD38^hi Bregs显著减少，首次揭示这种减少可能在AA的免疫病理中起重要作用。此外，Bregs的恢复与治疗反应无相关性，说明该亚群可能是疾病状态的标志物，而非治疗反应的预测因子。

3 自然杀伤细胞

自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）细胞是全身广泛分布的大颗粒淋巴细胞，能通过分泌细胞因子、趋化因子，以及释放细胞毒性颗粒方式发挥其细胞毒性和免疫调节的作用。NK细胞的功能与自身免疫性疾病的发病机制紧密相关。SAA患者的NK细胞在数量和功能上，特别是杀伤能力和免疫调节能力方面均显著下降。LI等^[25]发现，新治疗的SAA患者外周血中NK细胞及其亚群的百分比较低，但在IST后有所上升。在SAA动物模型及患者的外周血中，NK细胞过度表达NK细胞受体2D（natural killer cell group 2D, NKG2D），研究发现，NK细胞通过NKG2D通路调节CD8⁺T细胞的过度活化，防止自体免疫反应进一步破坏骨髓环境^[26]。非SAA患者外周血中CD56^bright NK细胞数量增加，且这些细胞具有高表达NKG2D和强免疫调节能力，表明这类NK细胞可能在非SAA的发病机制中起保护作用^[27]。此外，SAA患者NK细胞的干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1, IRF1）表达同样显著增加，但IRF1的上调导致NK细胞功能障碍并激活CTL，进而影响免疫调节^[28]。功能失调的NK细胞会削弱免疫监视，不能抑制髓系树突状细胞（myeloid dendritic cells, mDCs）与CD8⁺T细胞相互作用的过度活化。

T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3, TIM-3）广泛存在于NK细胞膜上，标志着NK细胞活化和成熟。新诊断的SAA患者NK细胞中TIM-3表达较低，且与全血细胞减少的严重程度相关，但IST后TIM-3表达可恢复正常^[29]。因此，推测在SAA中，TIM-3低表达可导致NK细胞功能障碍，促进骨髓衰竭。

LIU等^[30]研究报道，分离SAA患者和健康人的外周血和骨髓液中NK细胞群体获得8组细胞亚群，其中正常诱导记忆样（cytokine-induced memory-like, CIML）NK细胞（标记为CIML-NK1）和活性CIML-NK细胞（标记为CIML-NK2）在SAA中最显著。SAA患者CIML-NK1比例显著升高，但CIML-NK2/总CIML细胞比值降低，且CLML-NK1/CIML-NK2细胞比值更高的患者预后较好。因此人们推测，CLML-NK1增多是SAA患者机体的保护性反应，而CIML-NK2比例降低则是代偿性耗竭所致，CIML-NK细胞可作为SAA治疗结果的预测指标。

4 树突状细胞

APCs是一种免疫细胞，主要功能是捕获、加工并传递给T细胞，触发免疫反应。树突状细胞（dendritic cells, DCs）是APCs中最关键的子集，对启动适应性免疫至关重要。DCs既能处理并传递病原体抗原给初始T细胞，启动特异性免疫反应，又能调节T细胞的分化和功能，促进其分化为效应T细胞或记忆T细胞。若DCs功能障碍，则会导致T细胞异常活化。mDCs是重要抗原呈递细胞，能分泌多种促炎细胞因子（如IL-12）促进T细胞向Th1类型分化。AA患者的mDCs数量及其表面共刺激分子（CD80、CD86）表达均显著增加。这种功能亢进导致T细胞异常活化，刺激其过度分泌IFN-γ等细胞毒性因子，并促使效应T细胞在骨髓中累积，加剧对造血细胞的免疫攻击，进一步损伤造血环境^[31]。

浆细胞样树突细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDCs）在维持免疫耐受和介导抗病毒免疫反应中发挥重要作用，并与T细胞直接接触以调节其功能。研究发现，AA患者体内pDCs显著减少，这不仅能削弱对效应T细胞的调控功能，导致CD8⁺T细胞异常活化，还与Th1/Th2失衡密切相关，进一步加剧Th1反应，导致HSPCs持续受到免疫攻击^[32]。

调节性树突细胞（regulatory dendritic cells, DCreg），又称耐受性DC，其可抑制过度的T细胞活化，通过分泌抗炎细胞因子诱导Tregs生成，以维持免疫耐受。但AA患者的DCreg功能丧失，无法有效抑制CD8⁺T细胞的活化，导致HSPCs遭受免疫攻击。同时，DCreg数量减少使效应T细胞在骨髓中引发局部免疫炎症，进一步破坏骨髓微环境^[33]。

5 巨噬细胞

巨噬细胞（macrophage cell, mø）是吞噬细胞的一种免疫细胞。既往实验表明，mø在IFN-α依赖的HSPCs损失中起关键作用，尽管其他髓系细胞和HSPCs数量大减，但骨髓mø依赖IFN-α而留存^[34]。基于此，MCCABE等^[34]认为，mø在AA疾病过程中不仅是信号的传递者，更是IFN-α的“传感器”。IFN-γ维持并增加了SAA小鼠的骨髓mø，导致HSPCs减少和血小板降低。此外，IFN-γ可以提高mø趋化因子受体，即趋化因子C-C-基元受体5（chemokine c-c-motif receptor 5, CCR5）表达。实验研究发现，阻断CCR5信号能降低IFN-γ的表达、增加HSPCs数量、恢复血小板水平并提高小鼠生存率^[35]。mø也是TNF-α的主要来源之一，SUN等^[36]发现，AA患者骨髓mø的TNF-α表达显著高于健康人，在AA小鼠模型中发现，缺乏TNF-α的mø表现出更低的IFN-γ诱导反应，骨髓损害也明显减轻，这说明TNF-α与IFN-γ具有协同作用，在AA中TNF-α是IFN-γ信号的重要放大器，其可增强IFN-γ的信号传递，从而加速HSPCs的消耗和微环境的破坏。最新研究表明，AA患者的mø过表达淋巴细胞激活基因3（lymphocyte activation gene 3, LAG-3），其通过抑制mø的抗原呈递功能参与AA的免疫调控^[37]。FU等^[38]发现，SAA患者巨噬细胞焦亡水平升高，实验结果表明是Toll样受体4通过丙酮酸激酶M2诱导mø焦亡，并增强CD8⁺T细胞的杀伤功能。

6 总结

综上所述，免疫异常在AA的发病机制中极为关键。“虫子”是AA发病的始动环节，“种子”的减少、“土壤”的破坏均是免疫损伤的结果。T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、DC细胞、mø细胞等免疫细胞的异常激活和调控失衡，持续攻击和破坏骨髓造血干细胞及骨髓微环境，从而阻碍人体造血功能。以上机制不仅揭示了免疫在AA发病中的核心地位，也为AA的免疫抑制治疗提供了理论基础。目前，造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）仍是SAA患者的首选方案，对于不适合HSCT的AA患者，IST联合血小板生成素受体激动剂的促造血治疗方案被视为一线方案。然而，HSCT后并发症、感染风险及移植后复发的问题，以及IST可能引发的免疫反应、器官毒性及治疗的不确定性，依然是AA患者面临的难题。随着对AA免疫学病理特征的深入研究，研究者逐渐发现新的治疗靶点，新兴的治疗方法如基因重组、基因重修饰^[39]等也应运而生。尽管这些新治疗方法尚未在临床广泛应用，甚至有些仍处于动物实验阶段，但随着研究的不断深入和理论的逐步完善，笔者相信未来能够为患者提供更精准和有效的治疗新策略。

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基金资助

国家自然科学基金(82474490)

黑龙江省重点研发计划项目(2023ZX06C15)

哈尔滨市科技计划自筹经费项目(2022ZCZJNS063)