间充质干细胞与淋巴管内皮祖细胞联合移植对小鼠后肢淋巴水肿的影响

摘要

目的 研究间充质干细胞（MSCs）与淋巴管内皮祖细胞（LEPCs）联合移植对小鼠后肢淋巴水肿的影响，为淋巴水肿疾病的细胞疗法提供新思路。方法 从C57BL/6小鼠骨髓中分离并培养MSCs，培养至3～4代，使用流式细胞术鉴定表型，使用成脂、成骨及成软骨分化实验鉴定多系分化潜能；从小鼠骨髓中分离单个核细胞后扩增培养，通过磁珠分选筛选出CD34+VEGFR-3+细胞，使用免疫荧光染色鉴定细胞表面标志物、内皮潜能，成管实验鉴定淋巴管分化能力；通过手术方式复制后肢淋巴水肿模型，将MSCs与LEPCs注射于淋巴水肿部位，测量足垫厚度，观察水肿变化，通过免疫组织化学染色观察淋巴管面积及数量变化，通过Western blotting检测淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)蛋白表达。对照组、MSCs组、LEPCs组和MSCs+LEPCs组各组间进行比较。结果 (1)分离并培养的MSCs呈长梭形，流式细胞术结果显示CD29、CD44和Sca1阳性表达，表达率分别为99.80%、99.70%和96.48%;CD45和CD11b阴性表达，表达率分别为0.04%和0.03%，符合间充质干细胞形态学特征及表型特征。成脂诱导分化可见脂滴形成，成骨诱导分化可见钙盐沉淀形成的“骨结节”，成软骨诱导分化可见软骨球形成，以上诱导分化实验验证了其具有三系分化能力。(2)分离并培养的LEPCs呈“铺路石”样，通过免疫荧光染色鉴定LEPCs细胞特异性表面抗原表达，VEGFR-3、CD34和CD133表达阳性，符合LEPCs细胞形态学特征及特异性标志物特征。Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色可见细胞质摄取Dil-Ac-LDL后呈现红色荧光，细胞膜结合FITC-UEA-1后显示绿色荧光，证明其具有内皮潜能。LYVE-1荧光染色阳性证明其具有向淋巴内皮细胞分化能力。成管实验可见小管形成，证明其具有分化为淋巴管的能力。(3)通过手术方式成功复制稳定的小鼠后肢淋巴水肿模型，术后第1天开始出现水肿，水肿至少持续4周，至第7天左右达到最大程度，足垫厚度为（3.984±0.171）mm。单纯手术组与非手术组第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31天足垫厚度比较，结果：a.不同时间点足垫厚度比较，差异有统计学意义（P <0.05）;b.单纯手术组与非手术组间足垫厚度比较，差异有统计学意义（P <0.05）;c.两组足垫厚度变化趋势比较，差异有统计学意义（P <0.05）。术后第7和31天，单纯手术组足垫厚度均大于非手术组（P <0.05）。(4)对照组、MSCs组、LEPCs组和MSCs+LEPCs组第1、4、7、10、13、16、19天足垫厚度比较，结果：a.不同时间点足垫厚度比较，差异有统计学意义（P <0.05）;b.4组足垫厚度比较，差异无统计学意义（P>0.05）;c.4组足垫厚度变化趋势比较，差异有统计学意义（P <0.05）。第19天，MSCs组、LEPCs组、MSCs+LEPCs组足垫厚度均小于对照组（P <0.05），且MSCs+LEPCs组足垫厚度小于LEPCs组和MSCs组（P <0.05）。MSCs+LEPCs组的淋巴管面积小于MSCs组、LEPCs组、对照组（P <0.05）,LYVE-1蛋白相对表达量高于MSCs组、LEPCs组、对照组（P <0.05）。结论 MSCs、LEPCs移植可以改善淋巴水肿，且两者联合移植改善淋巴水肿效果优于单一移植。

关键词

间充质干细胞 / 淋巴管内皮祖细胞 / 淋巴水肿