N6-甲基腺苷修饰及其在肺动脉高压中的研究进展

N6-methyladenosine modification and its roles in pulmonary hypertension

摘要

N6-甲基腺苷（m6A）修饰是一种常见的RNA甲基化修饰，在许多的病理生理过程中起重要作用，与许多疾病的发生、发展密切相关，主要由甲基转移酶、去甲基化酶和m6A结合蛋白调节。肺动脉高压是一种常见的慢性呼吸系统疾病，且发病率较高，其主要病理特征是肺血管重塑，但发病机制尚不完全明确，并缺乏根治的方法。越来越多的证据表明，m6A修饰作为一种持续动态调节，可对肺动脉高压的特定基因表达和病理生理过程产生影响，参与肺动脉高压的发生、发展。通过对m6A修饰及其相关蛋白在肺动脉高压中的分子机制的研究，为肺动脉高压的治疗提供新思路和靶点。

Abstract

N6-methyladenosine modification is one of the most prevalent forms of RNA methylation, which plays an important role in various pathophysiological processes and is closely associated with the onset and progression of numerous diseases. It is primarily regulated by methyltransferase, demethylase and m6A-binding protein. Pulmonary hypertension is a common chronic respiratory disease with a high morbidity. Pulmonary vascular remodeling is the main pathological feature of the disease. However, its underlying pathogenesis remains incompletely understood, and there is currently a lack of curative treatment options. An increasing body of evidence indicates that N6-methyladenosine modification, as a continuously dynamic regulatory mechanism, can influence the expression of specific genes and pathophysiological processes involved in pulmonary hypertension, thereby contributing to its onset and progression. Investigating the molecular mechanisms of N6-methyladenosine modification and its associated proteins in pulmonary hypertension may provide novel insights and potential therapeutic targets for the treatment of this disease.

关键词

肺动脉高压 / N6-甲基腺苷 / 甲基化修饰蛋白 / 分子机制

Key words

pulmonary hypertension / N6-methyladenosine / methylation regulator / molecular mechanism

肺动脉高压（pulmonary hypertension, PH）是一种多因素引起的慢性肺部疾病，主要特征是肺血管重塑、肺血管阻力和肺动脉压持续升高，导致右心负荷增加和右心室肥厚，最终导致右心衰竭甚至死亡^[1]。世界肺动脉高压研讨会根据其病因和致病机制将PH分为5类，不同类型的PH有着共同的组织病理学特征，包括内膜和中膜增厚、肺小动脉肌化、肺外膜纤维化和原位血栓形成。多种细胞参与上述病理学改变，如内皮细胞、平滑肌细胞、外膜成纤维细胞、炎症细胞^[2]。PH可以独立发病，也可以继发于其他疾病，其发病率较高，且预后不良^[3]。尽管目前对PH的治疗可以改善患者的生活质量和短期生存率，但不能治愈，患者长期预后差，病死率高。目前对于PH的发病机制和病理生理的研究已经取得了一些进展，但其具体机制尚不清楚^[4]。因此，更好地了解PH的发病机制对于确定新的治疗靶点至关重要。

核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）修饰作为哺乳动物表观遗传调控的重要组成部分，在各种病理生理过程中发挥着重要作用。RNA可以发生> 100种不同的修饰，其中N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）修饰是最丰富和最普遍的化学修饰^[5]。m6A修饰是一种动态可逆的修饰，主要通过甲基转移酶、去甲基酶和m6A结合蛋白调节^[6]。一些研究表明m6A通过调节mRNA的稳定性、翻译、核输出和衰变，参与许多生物过程^[7]。失调的m6A可参与肿瘤、炎症、代谢性疾病、心血管疾病和衰老^[8]。m6A的动态可逆调节对PH的基因表达和病理生理过程产生影响，参与PH的发生、发展。本文综述了m6A修饰在PH中的作用和机制，分析其分子特征、生物学功能及其对PH的影响。

1 m6A修饰蛋白的组成及功能

m6A修饰是指RNA腺苷第6位氮原子的甲基化修饰，是真核生物mRNA中最常见和最丰富的内部修饰，约占已知RNA修饰的97.4%^[9]。m6A也广泛存在于非编码RNA中，包括微小RNA（microRNA, miRNA）、长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）和环状RNA（circular RNA, circRNA）。m6A的修饰主要发生在3′–非翻译区、终止密码子附近，以及一致基序RRACH的内部长外显子内（R=A/G，H=A/C/U）。m6A修饰是动态可逆的修饰，主要通过甲基转移酶复合物、去甲基化酶、m6A结合蛋白调节。

甲基转移酶复合物主要催化活性甲基供体（如S-腺苷甲硫氨酸）上的甲基转移至RNA上，并上调RNA的甲基化水平。其主要包括甲基转移酶样3（methyltransferase like 3, METTL3）、甲基转移酶样14（methyltransferase like 14, METTL14）、Wilms肿瘤1相关蛋白（Wilms′ tumor 1-associating protein, WTAP）、RNA结合基序蛋白15、病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白、锌指CCCH结构域包含蛋白13等。METTL3、METTL14是甲基转移酶复合物的核心组分，METTL3作为催化活性亚基，负责将活性甲基供体上的甲基转移到受体腺苷第6位的氮原子上。而METTL14与METTL3形成共定位的异源二聚体，主要负责与mRNA结合，并协助甲基定位，在底物识别和增强METTL3甲基转移酶活性方面起着关键作用^[10]。WATP是调控亚基，可以结合METTL3-METTL14二聚体并诱导其向底物招募及定位^[11]。其他甲基转移酶的功能还需进一步的探索。

去甲基化酶有去除RNA上甲基的作用，主要包括脂肪含量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associbted protein, FTO）和α-酮戊二酸依赖的双加氧酶碱性B同源物5（alkB homolog 5, ALKBH5）。这两种酶通过不同途径发挥相似作用。FTO主要通过氧化m6A生成不稳定的中间产物N6-羟甲基腺苷和N6-甲酰基腺苷，进而生成正常腺苷^[12]。而ALKBH5直接从m6A甲基化腺嘌呤中去除甲基^[13]。

m6A结合蛋白可以特异性识别m6A位点，主要包括YTH结构域蛋白家族成员，可分为2个不同的亚家族：YTHDF1/2/3和YTHDC1/2。YTHDC1主要参与mRNA从细胞核的转运，也参与mRNA剪接的调控，而YTHDC2通过识别m6A修饰影响mRNA的稳定性和翻译。YTHDF2通过选择性识别m6A并加速mRNA的降解。YTHDF1、YTHDF3促进m6A修饰的mRNA的翻译。目前已知的其他几种m6A结合蛋白，如胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1/2/3、真核起始因子3和异质核糖核蛋白A2/B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1, HNRNP A2/B1）也影响mRNA的剪接、翻译、稳定性和降解^[14]。

2 m6A修饰在PH中的研究进展

m6A修饰是表观遗传学修饰的重要组成部分，在许多生物过程和疾病的发病机制中发挥重要作用，是分子生物学领域研究的热点。其研究主要集中在肿瘤、胚胎及神经元发育、炎症疾病、免疫系统疾病、心血管疾病、代谢紊乱、细菌耐药、病毒复制和衰老。近年来许多研究已经表明m6A修饰在PH的发生、发展中起重要作用，且不同的m6A调节蛋白在PH中起不同作用。

2.1　m6A甲基转移酶在PH中的研究进展

m6A甲基转移酶作为m6A修饰的写入器通过影响肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs）的增殖、迁移、凋亡促进PH的发生、发展。有研究发现在特发性肺动脉高压（idiopathic pulmonary hypertension, IPAH）患者外周血中总m6A水平升高，且在低氧诱导PH大鼠模型、低氧处理及血小板源性生长因子BB诱导的PASMCs中，METTL3和YTHDF 1表达均增加，且升高m6A可能影响与细胞增殖、凋亡相关的基因（如RPS27A、Smad3、TP53、Foxd3）的甲基化水平，参与IPAH发生^[15]。体内和体外研究均发现METTL3 mRNA和蛋白异常上调，且下调METTL3可减弱PASMCs增殖和迁移^[15-16]。表明在PH中METTL3表达升高，影响m6A水平，促进PH的发生、发展。但XU等^[17]在出生后缺氧诱导的PH大鼠模型中研究发现，出生后缺氧可导致PH，这可以持续到成年。PH的发生和持续可能是由于METTL3的持续低表达影响了PH相关基因的m6A水平。研究发现17β-雌二醇通过上调METTL3水平，促进磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6 bisphosphatase 3, PFKFB3）mRNA m6A甲基化水平，促进PFKFB3蛋白表达，最终促进平滑肌细胞增殖、迁移能力^[18]。真核翻译起始因子2（eukaryotic initiation factor 2, eIF2）是一类异源三聚体的G蛋白，由α、β、γ亚基组成，其中eIF2α是哺乳动物细胞中代谢应激反应的关键因子，研究发现eIF2α在野百合碱诱导的PAH肺血管重构中起着非常重要的作用，METTL3、WTAP和YTHDF1可促进mRNA的m6A修饰，上调eIF2α促进PAH肺血管重构^[19]。磷酸酶和紧张素同源物（phosphatase and tensin homologue, PTEN）负责正常细胞的维持并作为肿瘤抑制因子，PTEN在缺氧肺组织和缺氧诱导的PASMCs中表达降低，沉默PTEN可促进不可逆的PH进展。在缺氧诱导的PASMCs中YTHDF2显著升高，YTHDF2通过识别METTL3介导的m6A修饰的PTEN mRNA，促进PTEN mRNA的降解。PTEN的降低通过激活PI3K/Akt信号通路导致PASMCs过度增殖，表明METTL3/YTHDF2/PTEN轴在缺氧诱导的PH中发挥重要作用^[20]。组蛋白甲基转移酶SETD2催化组蛋白H3上36位赖氨酸的三甲基化，ZHOU等^[21]研究发现在缺氧诱导的PH小鼠PASMCs中SETD2和METTL14表达升高，而PASMCs中SETD2的缺乏可降低METTL14表达水平和m6A RNA甲基化水平，保护小鼠免受缺氧诱导的PH。YAO等^[22]研究发现在缺氧诱导的PH和PASMCs中，髓系嗜生态病毒整合位点1（myeloid ecotropic viral integration site 1, MEIS1）表达下调。而过表达MEIS1可逆转缺氧诱导下PASMCs的增殖和迁移，提示MEIS1介导肺动脉重塑参与PH，且在缺氧条件下MEIS1通过METTL14/MEIS1/p21信号通路诱导PASMCs增殖和迁移。

综上所述，m6A甲基转移酶尤其是METTL3和METTL14在PH中表达升高，使m6A水平升高，影响PASMCs的增殖、迁移，参与PH发展，但在不同的动物模型中有不同的表现。

2.2　m6A去甲基化酶在PH中的研究进展

有研究发现在野百合碱（Monocrotaline, MCT）诱导的PAH大鼠模型中，肺组织中FTO和ALKBH5的表达减少，FTO表达下调可能在mRNA m6A修饰中起主导作用，并过调节炎症、糖酵解、转化生长因子-β家族受体成员、细胞外基质受体相互作用和血小板衍生生长因子信号通路参与PH的发生^[23]。而XU等^[24]在缺氧诱导的PH大鼠肺组织中发现FTO表达升高，高表达的FTO通过调节周期素D1（细胞G1/S转变的正向调节因子）m6A的丰度，破坏Cyclin D1的稳定性，引起细胞周期阻滞，诱导细胞增殖，从而参与PH发生。

上述研究表明，m6A甲基转移酶参与PH发生、发展，但其研究相对较少，具体的信号通路也尚不明确，有待进一步的研究。

2.3　m6A结合蛋白在PH中的研究进展

目前，对PH中m6A结合蛋白的研究主要集中于YTHDC1和YTHDF1/2。ZHENG等^[25]研究发现，体外缺氧诱导的肺动脉内皮细胞（pulmonary artery endothelial cell, PAEC）和Sugen缺氧PH小鼠模型中YTHDC1表达下调，YTHDC1重组蛋白被发现抑制PAEC增殖；YTHDC1靶向的差异性表达基因在血管生成、内皮细胞迁移、流体剪切应力和干细胞维持中富集，也发现NF-κB1、Foxd3可能参与了YTHDC1调控。细胞焦亡是一种程序性细胞死亡的形式，参与了低氧性PH （hypoxic pulmonary hypertension, HPH）病理生理进展。在缺氧诱导的PAEC中研究发现YTHDC1介导的m6A诱导了FENDRR（LncRNA FOXF1-AS1，一种长链非编码）下调，进而通过减少动力蛋白相关蛋白1启动子区域RNA-DNA三联体的形成来抑制启动子DNA甲基化，从而促进缺氧诱导的PAEC焦亡^[26]。也有研究发现YTHDF1通过以m6A依赖的方式增强黑色素瘤抗原家族D1翻译，促进PASMCs增殖和表型转换^[27]。LIU等^[28]研究发现METTL14和YTHDF2在PAH中显著升高；YTHDF2识别m6A修饰的GRB-2相关接头蛋白（GRB-2 related adaptor protein, GRAP）mRNA（GRAP是GRB-2相关接头蛋白，其过表达通过抑制Ras/Erk信号通路，在体外和体内显著减轻PAH PASMCs的增殖和侵袭能力），并促进GRAP mRNA的降解，导致GRAP表达降低，促进PASMCs的增殖迁移和PH发展。HU等^[29]在小鼠PH模型中研究发现，在PH的发展过程中，YTHDF2蛋白表达上调通过促进血红素加氧酶1（heme oxygenase 1, Hmox1）mRNA降解，加速了PASMCs的早期巨噬细胞活化和后期增生，促进PH发生、发展。有研究发现，在MCT诱导的PH大鼠模型中，HNRNPA2B1表达水平升高。HNRNPA2B1的靶基因在PASMC的肌肉细胞分化和血管发育调控中富集。此外，预测的转录因子Foxd2/3和NF-κB可能参与HNRNPA2B1的调控，HNRNPA2B1可调控PASMCs增殖和表型转变，促进PH发展^[30]。SU等^[31]研究表明在缺氧诱导的PAH大鼠肺组织中circRNA的m6A丰度显著降低。此外，在缺氧条件下，m6A调节因子影响circRNA-miRNA-mRNA共表达网络，导致Foxo、Wnt信号通路激活，同时发现circXpo6和circTmtc3的m6A水平与PH有相关性。

综上所述，m6A结合蛋白可能通过影响细胞增殖、凋亡等相关通路中分子mRNA或circRNA参与PH的发生、发展。

3 总结与展望

PH是一种常见慢性呼吸系统疾病，其发病率和致死率都极高，预后较差，目前缺乏根治的方法。m6A修饰是最常见的RNA甲基化修饰，是动态可逆的过程，主要通过甲基转移酶复合物、去甲基化酶和m6A结合蛋白调节，已经发现多种m6A修饰的调节蛋白。目前的研究发现m6A及其调节蛋白主要通过促进PASMCs/PAEC增殖、抗凋亡、炎症等信号通路参与肺血管重塑，从而促进PH形成。但目前m6A在PH中的研究是相对较少的，部分m6A调节蛋白的作用尚不清楚，具体的信号通路也不明确，且部分的作用机制是通过生物信息学分析研究，缺乏具体的实验验证。现有的研究表明m6A主要在PASMCs/PAEC增殖、凋亡中起重要作用，但m6A修饰在其他PH的发病机制中的作用尚未可知，有待进一步研究。未来的研究不仅需探明m6A相关蛋白在PH中的表达变化，还要研究各种甲基化酶、去甲基化酶如何调节下游蛋白的表达参与PH形成，以及m6A结合蛋白如何介导PH中m6A甲基化的活性和机制。目前的研究大多为动物实验，缺乏临床的研究。而且调节m6A失调治疗PH的可能性也尚不明确，有待进一步的研究。最终针对m6A及其相关的信号通路开发治疗PH的安全、有效、经济的药物，减轻该疾病负担。

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基金资助

国家自然科学基金(82360014)

国家自然科学基金(81960014)

甘肃省自然科学基金(22JR5RA955)