胶质瘤患者层粘连蛋白γ1、玻连蛋白的表达及其临床意义

Expression and clinical implications of laminin subunit gamma-1 and vitronectin in glioma patients

摘要

目的 研究胶质瘤患者层粘连蛋白γ1(LAMC1)、玻连蛋白（VTN）的表达及临床意义。方法 选取2021年2月—2023年7月海军特色医学中心收治的109例胶质瘤患者作为研究组，另取同期该院45例脑部外伤手术患者作为对照组。随访1年，根据胶质瘤患者预后分为死亡组与生存组。采用免疫组织化学法检测LAMC1表达水平，酶联免疫吸附试验检测血清VTN水平。采用多因素Cox回归模型分析胶质瘤患者预后的影响因素，绘制Kaplan-Meier生存曲线分析LAMC1、VTN表达与胶质瘤患者1年生存率的关系。结果 研究组LAMC1、VTN水平均高于对照组（P <0.05）。LAMC1高表达组肿瘤直径≥5 cm、临床分期Ⅲ、Ⅳ期及Karnofsky功能状态（KPS）评分<70分的患者构成均高于LAMC1低表达组（P <0.05）。VTN高表达组肿瘤直径≥5 cm、临床分期Ⅲ、Ⅳ期和KPS评分<70分的患者构成均高于VTN低表达组（P <0.05）。随访1年，所有胶质瘤患者均未失访，其中死亡63例，生存46例。LAMC1高表达与低表达患者的生存曲线比较，差异有统计学意义（P <0.05）。VTN高表达与低表达患者的生存曲线比较，差异有统计学意义（P <0.05）。多因素逐步Cox回归分析结果：LAMC1高表达[H^R=3.425(95%CI:1.505,7.790)]、VTN高表达[H^R=2.798(95%CI:1.230,6.366)]均为胶质瘤患者1年内死亡的危险因素（P <0.05）。结论 胶质瘤组织中LAMC1高表达、血清VTN高表达，其表达与肿瘤直径、临床分期、KPS评分及1年预后有关，且两者均可作为胶质瘤患者预后评估的生物学标志物。

Abstract

Objective To investigate the expression and clinical implications of laminin subunit gamma-1 (LAMC1) and vitronectin (VTN) in glioma patients. Methods A total of 109 patients with glioma treated in our hospital from February 2021 to July 2023 were selected as the study group, and 45 patients with brain trauma treated in the hospital during the same period were selected as the control group. Patients with glioma were followed up for 1 year and divided into the death group and the survival group according to the prognosis. The expression level of LAMC1 was detected by immunohistochemistry and serum VTN was determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Multivariable Cox regression was used to analyze the prognostic factors of glioma patients, and Kaplan-Meier curve was drawn to determine the relationship between LAMC1 and VTN expressions and the 1-year survival rate of glioma patients. Results The levels of LAMC1 and VTN in the study group were higher than those in the control group (P < 0.05). The proportion of patients with tumor diameter ≥ 5 cm, clinical stage III-IV, and Karnofsky Performance Status (KPS) score < 70 was significantly higher in the high LAMC1 expression group compared to the low expression group (P < 0.05). The proportion of patients with tumor diameter ≥ 5 cm, clinical stage III-IV, and KPS score < 70 was higher in the high VTN expression group compared to the low expression group (P < 0.05). After 1 year of follow-up, all glioma patients were not lost to follow-up. Among them, 63 died and 46 survived. The survival curves of patients with high versus low LAMC1 expression were compared, showing a statistically significant difference (P < 0.05). The survival curve of patients with high expression of VTN was also significantly different than that of patients with low expression of VTN (P < 0.05). The multivariable stepwise Cox regression analysis demonstrated that high LAMC1 expression [H^R = 3.425 (95% CI: 1.505, 7.790) ] and high VTN expression [H^R = 2.798 (95% CI: 1.230, 6.366) ] were both risk factors for death within 1 year in glioma patients (P < 0.05). Conclusion LAMC1 and VTN are highly expressed in glioma tissues and are associated with tumor size, WHO stage, KPS score, and 1-year prognosis. Both of them may serve as potential biomarkers for prognostic assessment.

Graphical abstract

关键词

胶质瘤 / 层粘连蛋白γ1 / 玻连蛋白 / 临床病理特征 / 预后

Key words

glioma / laminin subunit gamma-1 / vitronectin / clinicopathological features / prognosis

胶质瘤是一种临床常见的脑肿瘤，约占原发性恶性脑肿瘤的80%，病情进展快，给患者的生命安全带来巨大威胁^[1]。近年来综合治疗为胶质瘤的治疗提供了新的方向，但治疗效果并不理想，尤其是对于恶性程度高的胶质母细胞瘤患者，其生存期通常< 2年^[2-3]。因此，早期有效诊断胶质瘤并准确预测预后意义重大。尽管很多研究已探索了胶质瘤中的肿瘤抑制因子和癌基因，但胶质瘤的发展、发生机制仍存在一定程度的不确定性。科学界对胶质瘤的形成与发展仍没有确凿的证据支持^[4]。层粘连蛋白γ1（laminin subunit gamma-1, LAMC1）广泛表达于层粘连蛋白亚基中，LAMC1表达水平上调与脑膜瘤患者预后密切相关^[5]。国外有研究指出，LAMC1在晚期与早期细胞形态发生中发挥重要作用，其表达上调可能促进肿瘤转移，其可能是治疗人类癌症的重要靶点^[6-7]。玻连蛋白（Vitronectin, VTN）与细胞外基质的形成关系密切，其可刺激细胞贴壁，并维持微小蛋白稳定。已有报道表明，VTN间接参与脑胶质瘤的发生、发展过程^[8]。目前，LAMC1、VTN表达水平与胶质瘤患者临床病理特征及预后的关系尚缺乏报道。本研究通过检测胶质瘤与正常脑组织LAMC1、VTN表达水平，探讨其与胶质瘤进展及预后的关系，期望为临床治疗胶质瘤提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1　一般资料

选取2021年2月—2023年7月海军特色医学中心收治的109例胶质瘤患者作为研究组。其中，男性67例，女性42例；年龄25～76岁，平均（51.34±10.48）岁。纳入标准：①术后病理学检查确诊为脑胶质瘤^[9]；②签署知情同意书；③既往未采用任何形式的抗肿瘤治疗；④年龄≥ 18岁。排除标准：①既往有颅脑手术史；②自身免疫性疾病；③其他肿瘤脑转移；④伴有急慢性感染；⑤合并其他类型恶性肿瘤；⑥凝血功能障碍；⑦妊娠或哺乳期女性。本研究通过院内医学伦理委员会审批（No：〔2020〕伦审批第009号）。另取同期本院45例脑部外伤手术患者作为对照组。其中，男性28例，女性17例；年龄24～77岁，平均（52.85±10.20）岁。纳入标准：①患有创伤性脑损伤且经内部减压手术治疗；②年龄≥18岁；③签署知情同意书。排除标准同研究组。两组性别构成、年龄比较，经χ² / t 检验，差异均无统计学意义（P >0.05）。

1.2　免疫组织化学法检测LAMC1表达

所有的正常脑组织或脑胶质瘤组织常规固定于10%中性缓冲甲醛溶液，行常规石蜡包埋后切片（厚度5 μm）。于二甲苯中脱蜡，采用3%过氧化氢H₂O₂孵育，过氧化物酶封闭切片。随后在1 mmol/L乙二胺四乙酸中行微波加热抗原修复。采用5%胎牛血清阻断非特异性结合位点。4 ℃条件下将大鼠抗LAMC1单克隆抗体（第一抗体）与切片孵育过夜。当第一抗体反应时，室温下孵育样品与HRP标记的山羊抗鼠二抗30～35 min。由2名经验丰富的病理科医师进行诊断，意见不一致则协商至一致。每个切片随机选择5个视野，在200倍下拍照，通过Image-Proplus 6.0软件测量每张组织照片的LAMC1表达。先校正照片光密度，根据免疫组织化学染色结果选择特定染色物颜色，用平均光密度评价LAMC1的表达。具体方法如下：首先检测有效测量区域的面积，然后检测该面积范围内目标染色区域的累积光密度值（integrated option density, IOD），LAMC1表达水平为两者的比值。

1.3　酶联免疫吸附试验检测血清VTN水平

术前抽取所有研究对象晨起空腹静脉血4 mL，离心分离血清（3 000 r/min离心15 min，离心半径6 cm），通过酶联免疫吸附试验检测血清VTN水平，试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司。

1.4　随访及预后

所有研究对象于术后即刻开始随访，随访1年。以电话、微信等形式每个月随访1次，以随访1年或患者死亡为随访终点，根据胶质瘤患者预后分为死亡组（46例）与生存组（63例）。

1.5　收集资料

包括年龄、性别、肿瘤直径、临床分期、肿瘤周围水肿（采用磁共振成像进行评估，T1加权成像通常显示肿瘤实质区为低信号，而T2加权成像则显示肿瘤实质区为高信号，周围水肿区表现为更高信号）、肿瘤部位、Karnofsky功能状态（Karnofsky performance scale, KPS）评分。

1.6　统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用t 检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ²检验；采用多因素逐步Cox回归模型分析胶质瘤患者预后的影响因素；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ²检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　两组LAMC1、VTN水平比较

研究组与对照组LAMC1、VTN水平比较，经t 检验，差异均有统计学意义（P <0.05），研究组LAMC1、VTN水平均高于对照组。见表1。

2.2　LAMC1、VTN表达与胶质瘤患者临床病理特征的关系

LAMC1高表达组与LAMC1低表达组肿瘤直径、临床分期和KPS评分构成比较，经χ²检验，差异均有统计学意义（P <0.05）；LAMC1高表达组肿瘤直径≥ 5 cm、临床分期Ⅲ、Ⅳ期及KPS评分< 70分的患者构成均高于LAMC1低表达组；LAMC1高表达组与LAMC1低表达组年龄、性别、肿瘤周围水肿和肿瘤部位构成比较，经χ²检验，差异均无统计学意义（P >0.05）。见表2。

VTN高表达组与VTN低表达组肿瘤直径、临床分期和KPS评分构成比较，经χ²检验，差异均有统计学意义（P <0.05）；VTN高表达组肿瘤直径≥5 cm、临床分期Ⅲ、Ⅳ期和KPS评分<70分的患者构成均高于VTN低表达组；VTN高表达组与VTN低表达组年龄、性别、肿瘤周围水肿和肿瘤部位构成比较，经χ²检验，差异均无统计学意义（P >0.05）。见表3。

2.3　LAMC1、VTN表达与胶质瘤患者1年总生存率的关系

随访1年，所有胶质瘤患者均未失访，其中死亡63例，生存46例。LAMC1高表达与低表达患者的1年总生存率分别为28.30%（15/53）、55.36%（31/56）。LAMC1高表达与低表达患者的生存曲线比较，经Log-rank χ²检验，差异有统计学意义（χ²=16.928，P =0.000）。见图1。

VTN高表达与低表达患者的1年总生存率分别为35.82%（24/67）、52.38%（22/42）。VTN高表达与低表达患者的生存曲线比较，经Log-rank χ²检验，差异有统计学意义（χ²=5.688，P =0.017）。见图2。

2.4　胶质瘤患者1年生存率的单因素分析

生存组与死亡组年龄、性别、肿瘤周围水肿、肿瘤部位、KPS评分比较，经χ²检验，差异无统计学意义（P > 0.05）；生存组与死亡组肿瘤直径比较，经χ²检验，差异有统计学意义（χ²=18.667，P =0.000），死亡组肿瘤直径≥5 cm比例高于生存组。见表4。

2.5　胶质瘤患者预后影响因素的多因素逐步Cox回归分析

以胶质瘤患者1年内是否死亡（否=0，是=1）为因变量，以肿瘤直径（<5 cm=0，≥5 cm=1）、LAMC1（低表达=0，高表达=1）、VTN（低表达=0，高表达=1）为自变量，进行多因素逐步Cox回归分析（引入水准为0.05，排除水准为0.10），结果表明：LAMC1高表达[H^R=3.425（95% CI：1.505，7.790）]、VTN高表达[H^R=2.798（95% CI：1.230，6.366）]均为胶质瘤患者1年内死亡的危险因素（P <0.05）。见表5。

3 讨论

目前，胶质瘤的发病机制尚未明确。有研究认为，胶质瘤的发生与多种因素密切相关，如遗传、电离辐射等^[10-12]。现阶段，临床通常采用手术切除联合放疗、化疗、生物治疗等方式治疗胶质瘤，但由于胶质瘤具有凋亡受阻、与正常脑组织界限不清、无限增殖等特点，外科手术完全切除难度加大；此外，由于血脑屏障等因素的存在，各种化疗药物在治疗肿瘤组织时受到限制，很难发挥有效的作用，甚至可能产生耐药性；最后，该病对放疗敏感性较低，严重影响患者预后^[13-14]。近些年来，尽管神经外科的治疗技术有所提高^[15]，但胶质瘤仍然是难以治疗的神经外科疾病之一。因此，如何有效地诊断和治疗胶质瘤，并准确预测患者的预后已成为临床医师研究的热门话题。

本研究中，研究组LAMC1水平高于对照组，LAMC1表达与胶质瘤临床分期关系密切，与唐连刚等^[16]的报道相似。分析其原因为LAMC1作为基底膜的组成部分，过度表达可能引起细胞外基质的异常重塑，这种重塑可能为肿瘤细胞提供更好的增殖、迁移和侵袭条件，进而促进胶质瘤的发展；胶质瘤组织中存在许多细胞类型，包括肿瘤细胞、免疫细胞、血管内皮细胞等，这些细胞可以产生多种细胞因子和信号分子，可能通过调节LAMC1的表达来影响胶质瘤的临床分期^[17-18]。国外有研究指出，宫颈癌中LAMC1表达水平上调，其表达与淋巴结转移、子宫肌层浸润、血管淋巴管浸润、FIGO分期、颈/附件受累关系密切^[19]。MOU等^[20]采用无偏随机存活森林分析247例肝细胞患者的转录组数据集，结果发现，LAMC1与患者总体无肿瘤存活率及肿瘤分期关系密切，且高表达者总体无肿瘤存活率较低，与本研究报道相似。国外有研究表明，LAMC1可能通过增强肿瘤细胞的运动和侵袭而促进肿瘤的发生、发展^[21]。本研究中，LAMC1高表达患者的1年生存率为28.30%低于LAMC1低表达患者的55.36%。唐连刚等^[16]对68例神经胶质瘤患者随访36个月，结果显示，LAMC1高表达者总体生存率比LAMC1低表达者低，与本研究报道相符。本研究中，研究组血清VTN水平比对照组高。分析其原因为VTN蛋白中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列可以与肿瘤细胞表面的整合素αVβ3结合，从而影响肿瘤干细胞的分化。这一作用间接促进了肿瘤的发展和进程。在胶质瘤患者中，胶质瘤细胞异常增殖会导致VTN的分泌与合成增加，进一步加剧了肿瘤的发生、发展^[22]。本研究中，VTN表达水平与胶质瘤患者肿瘤直径、临床分期、KPS评分有关，与周秀珍等^[23]研究报道相符。分析其原因为VTN的表达可能受肿瘤微环境中多种细胞类型和信号分子的调控，例如肿瘤相关的炎症细胞和细胞因子可能促进VTN的表达，从而影响肿瘤的大小、分期和KPS评分；VTN的高表达可能与胶质瘤的浸润和转移能力增强有关，VTN可以促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，从而影响肿瘤的分期和KPS评分^[24-25]。本研究中，VTN高表达患者的1年生存率为35.82%，低于VTN低表达患者的52.38%。分析其原因为VTN的高表达可以刺激细胞附着，同时影响胃管蛋白的结构，减少对肿瘤细胞凋亡的促进作用，进而促进胶质瘤细胞异常增殖，并增强其迁移能力。这些因素对患者的预后产生不良影响^[26]。本研究中，LAMC1高表达、VTN高表达为胶质瘤患者1年内死亡的危险因素，进一步明确了LAMC1、VTN异常表达与胶质瘤患者不良预后关系密切。虽然现有报道中未直接研究LAMC1和玻连蛋白在胶质瘤中联合高表达的原因，但可以推测两者可能通过不同的机制共同促进胶质瘤的恶性进展。LAMC1和玻连蛋白的联合高表达在胶质瘤中可能通过促进细胞黏附、侵袭和免疫调节等机制，加剧肿瘤的恶性进展，并显著影响患者的预后。这一发现为胶质瘤的诊断和治疗提供了新的思路，值得进一步深入研究。

综上所述，胶质瘤组织中LAMC1高表达、血清VTN高表达，其表达与肿瘤直径、临床分期、KPS评分及1年预后有关，且两者均可作为胶质瘤患者预后评估的生物学标志物。然而因本研究方法较基础，随访时间较短，研究样本量相对较小，尚需大样本及基础研究验证LAMC1、VTN参与胶质瘤发生、发展的作用机制。

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基金资助

上海市自然科学基金(22ZR1413800)