联合抗生素对伪无菌模型大鼠的肠道菌群及其代谢的影响

摘要

目的 比较联合抗生素经灌胃与自由饮水两种给药复制大鼠伪无菌模型的效果，为优化伪无菌模型复制方法提供参考。方法 将SD大鼠随机分为正常组、抗生素灌胃组和抗生素饮水组，每组5只。抗生素灌胃组采用含200 mg/mL氨苄西林、200 mg/mL甲硝唑、200 mg/mL新霉素和100 mg/mL万古霉素的混悬液，按1 mL/kg体积每日灌胃；抗生素饮水组在灭菌饮用水中加入0.5 g/L氨苄西林、0.5 g/L甲硝唑、0.5 g/L新霉素和0.25 g/L万古霉素，大鼠自由饮水，干预14 d。干预后第5、10、14天，无菌取大鼠粪便进行菌群培养；14 d后取大鼠粪便进行16S核糖体rDNA(16S rDNA)测序；分离肝脏、脾脏、肾脏、胸腺称重，取各组大鼠结肠组织进行苏木精-伊红（HE）染色及免疫组织化学染色。结果 与正常组比较，在有氧和厌氧培养条件下，第5天起抗生素灌胃组和抗生素饮水组粪便菌落显著减少，伪无菌大鼠模型复制成功并稳定维持到第14天。与正常组比较，抗生素饮水组第2～6天体重均下降（P<0.05），第7～14天体重差异均无统计学意义（P >0.05）；抗生素灌胃组第6天体重高于正常组（P<0.05）。正常组、抗生素灌胃组和抗生素饮水组大鼠肝脏、肾脏、脾脏和胸腺系数的比较，差异均无统计学意义（P >0.05）。各组大鼠结肠免疫组织化学结果显示，与正常组比较，抗生素灌胃组与抗生素饮水组中紧密连接蛋白闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白（Occludin）在肠上皮和腺上皮细胞细胞质及细胞膜呈阳性表达，棕黄色染色较多。基于16S rDNA测序的α多样性分析显示：与正常组比较，抗生素灌胃组和抗生素饮水组的ACE、Sobs及Shannon指数均降低（P<0.05）,Simpson指数均升高（P<0.05）；抗生素饮水组的Simpson指数较抗生素灌胃组升高（P<0.05）。基于Bray-Curtis距离的β多样性分析显示：正常组样本与抗生素灌胃组、抗生素饮水组样本明显分离（ANOSIM相似性分析：r=0.816,P=0.001）。抗生素灌胃组和抗生素饮水组变形菌门丰度均高于正常组（均P<0.05），抗生素灌胃组与抗生素饮水组比较，差异无统计学意义（P >0.05）；正常组厚壁菌门、拟杆菌门及放线菌门丰度高于抗生素灌胃组和抗生素饮水组（均P<0.05）。抗生素饮水组摩根菌属丰度高于抗生素灌胃组和正常组（均P<0.05）；抗生素灌胃组埃希-志贺菌属丰度高于抗生素饮水组和正常组（P<0.05）；正常组乳酸杆菌属、拟杆菌属及norank＿f＿＿Muribaculaceae属丰度高于抗生素灌胃组和抗生素饮水组（均P<0.05）。基于KEGG的菌群功能预测分析结果显示：在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、萜类化合物和聚酮类化合物代谢、辅助因子和维生素代谢等多个途径上，3组预测丰度的总体比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 联合抗生素经灌胃和自由饮水给药均可在14 d内有效复制SD大鼠伪无菌模型，但抗生素灌胃组与抗生素饮水组均出现条件致病菌异常繁殖现象，这提示抗生素干预可能通过筛选压力改变菌群结构，使原本处于低丰度的潜在致病菌获得生长优势。这为研究者根据实验目标菌群选择适宜的抗生素给药策略复制伪无菌模型提供了参考。

关键词

16s rDNA测序 / 伪无菌大鼠 / 肠道屏障 / 闭锁小带蛋白-1 / 闭合蛋白 / 抗生素联合使用