构建稳定表达TDP-43^A315T突变的肌萎缩侧索硬化细胞模型并重现TDP-43蛋白病理特征的实验研究

摘要

目的 通过在Neuro-2a细胞中构建稳定表达TDP-43^A315T的肌萎缩侧索硬化（ALS）体外模型，以期为药物筛选和致病机制的研究提供实验基础。方法 通过慢病毒介导的转染技术，在Neuro-2a细胞株中构建稳定表达野生型TDP-43与TDP-43^A315T突变型的细胞株。该研究设置3个分组，分别为空载组（GFP-Control组，简称GL组）转染质粒pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMVMCS-3xFLAG-WPRE；对照组（野生型人类TDP-43序列，简称WT组）转染质粒pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-TARDBP-3xFLAG-WPRE；模型组（人类TDP-43A315T突变序列，简称M组）转染质粒pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-TARDBP（A315T）-3xFLAG-WPRE。采用CCK-8法和腺苷三磷酸（ATP）含量检测评估细胞活力与能量代谢；通过Western blotting检测和免疫荧光染色实验分析TDP-43的亚细胞定位、剪切片段形成、泛素化聚集及凋亡相关蛋白的表达；利用生化试剂盒检测氧化应激相关酶活性变化。结果 GL组、WT组ATP蛋白相对表达量均高于M组（P<0.05）。M组的cleaved Caspase-3、B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子、Bcl-2相关X蛋白的表达量均高于GL组及WT组（P<0.05）。M组TDP-43免疫荧光染色在细胞质中的占比高于WT组（P<0.05）。M组细胞质TDP-43蛋白水平高于WT组（P<0.05）。M组5、15、20μmol/L过氧化氢干预后细胞存活率均高于GL组、WT组（P<0.05）,40、50μmol/L过氧化氢干预后细胞存活率均低于GL组、WT组（P<0.05）。M组T-AOC、TGSH均高于GL组、WT组（P<0.05）。M组Nrf2、HO-1表达水平均低于WT组、GL组（P<0.05）。结论 该研究成功构建了1个稳定表达和典型病理特征的TDP-43^A315TNeuro-2a细胞模型。TDP-43^A315T突变通过诱导线粒体功能障碍、细胞凋亡、TDP-43蛋白病理改变及氧化应激防御系统失调，协同导致神经元损伤，为解析ALS发病机制及药物筛选提供了体外研究工具。

关键词

肌萎缩侧索硬化症 / TDP-43^A315T突变 / 体外模型 / TDP-43蛋白

基金资助

国家重点研发计划(2023YFC3504304); 北京中医药大学解码中医项目(BZY-JMZY-2022-002)