EFhd2和ATG16L1在二乙酰吗啡致神经元自噬中的作用研究

摘要

目的 探讨EF-Hand结构域家族成员2(EFhd2)和自噬相关蛋白16L1(ATG16L1)在二乙酰吗啡致神经元自噬中的作用。方法 12只雄性SD大鼠随机分为对照组和模型组，每组6只。模型组腹腔注射二乙酰吗啡，连续20 d，复制二乙酰吗啡成瘾模型；对照组注射生理盐水。取大鼠脑组织，蛋白质组学测序筛选差异蛋白，苏木精-伊红（HE）染色观察脑组织形态学改变，以及自噬蛋白表达水平变化。采用CCK-8法检测二乙酰吗啡干预细胞的最适浓度及细胞吸光度值；Western blotting检测EFhd2、ATG16L1及自噬相关蛋白P62、LC3蛋白水平；构建EFhd2敲低原代大鼠皮质神经元，Western blotting检测验证转染效率；GFP-RFP-LC3双荧光慢病毒检测神经元自噬通量；蛋白质作用位点预测，以及免疫共沉淀（CO-IP）验证EFhd2和ATG16L1相互作用。使用Peretinoin激活ATG16L1后检测细胞存活率及自噬水平。结果 蛋白质组学筛选出差异蛋白，在差异显著的蛋白中通过与自噬数据库交互确定研究主因子为EFhd2。HE染色结果显示，模型组相对于对照组大鼠脑组织染色较浅，细胞核数量减少。Western blotting检测结果显示，对照组P62蛋白相对表达量高于模型组（P<0.05）,LC3Ⅱ/Ⅰ、EFhd2和ATG16L1蛋白相对表达量均低于模型组（P<0.05）。体外细胞实验显示，二乙酰吗啡干预神经元细胞后，与空载病毒对照组比较，DA组细胞吸光度值降低（P<0.05），自噬相关蛋白相对表达量升高（P<0.05）；而敲低EFhd2后使用二乙酰吗啡干预后，与DA组比较，shEFhd2+DA组细胞吸光度值升高（P<0.05），自噬蛋白相对表达量下降（P<0.05），自噬水平降低（P<0.05）。蛋白质相互作用预测及CO-IP结果显示，EFhd2和ATG16L1存在相互作用。激活ATG16L1后，与shEFhd2+DA组比较，shEFhd2+Peretinoin+DA组细胞吸光度值降低（P<0.05），自噬水平升高（P<0.05）。结论 EFhd2、ATG16L1参与了二乙酰吗啡致神经元自噬过程，干预EFhd2表达可降低二乙酰吗啡致神经元自噬水平，为神经系统疾病防治提供新靶点。

关键词

二乙酰吗啡 / 自噬 / EF-Hand结构域家族成员2 / 自噬相关蛋白16L1

基金资助

国家自然科学基金（82360256;82460257）; 广东省脑连接图谱重点实验室资助项目（2023B1212060055）