基于胞嘧啶碱基编辑器构建ESM1基因敲除Hela细胞系

摘要

目的：基于胞嘧啶碱基编辑器(CBE)提前引入终止密码子构建内皮细胞特异性分子1 (ESM1)基因敲除Hela细胞系。方法：根据NCBI数据库ESM1序列信息(Gene ID:11082),利用在线软件Benchling在ESM1基因1号外显子上设计2个向导sgRNA,构建对应的pX330-ESM1-sgRNA表达载体。将BE4max、ACBE-ASR、pX330-ESM1-sgRNA 3个质粒共转染Hela细胞，用嘌呤霉素富集筛选CBE工作阳性细胞。PCR扩增含靶点的序列并进行Sanger测序，比较2个sgRNA的效率。通过有限稀释法筛选单克隆细胞，扩大培养后进行测序及Western Blot检测。结果：测序结果显示pX330-ESM1-sgRNA表达质粒构建成功，sgRNA2的编辑效率为66%,远高于sgRNA1的编辑效率；10组细胞单克隆中有6组细胞的靶点进行了双等位基因精确编辑，成功提前引入了终止密码子；Western Blot结果显示ESM1被成功提前终止翻译，达到基因敲除的目的。结论：基于胞嘧啶碱基编辑器提前引入终止密码子的策略成功构建了ESM1基因敲除Hela细胞系，为后续研究ESM1在宫颈癌中的作用机制提供了实验材料，奠定了基础。

关键词

胞嘧啶碱基编辑器 / ESM1 / 基因敲除