高亲和力重组人硫氧还蛋白的原核表达条件的优化和活性鉴定

摘要

目的：确定重组人硫氧还蛋白（Trx）在大肠杆菌中的最佳表达条件，并对其表达产物进行分离纯化及初步活性鉴定。方法：将人Trx蛋白全序列克隆至pET-30a（+）载体，再将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组人Trx的原核表达，并从诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度3个方面对表达条件进行优化。随后采用亲和层析法对重组人Trx蛋白进行分离纯化。利用二硫苏糖醇（DTT）还原法比较不同诱导条件下重组人Trx蛋白和商业化人Trx蛋白的活性差异。通过硫氧还蛋白还原酶（TrxR）抑制试验评估该重组人Trx蛋白在高通量TrxR抑制剂筛选中的应用潜力。结果：SDS-PAGE分析结果显示，在30℃、0.6 mmol·L^-1 IPTG诱导9 h时，Trx表达量最高(约2.4 mg·mL^-1)。酶活分析表明，该条件下获得的Trx比活力最高，约为20.36 U·mg^-1,显著高于商品化蛋白。TrxR抑制试验显示，使用纯化Trx可将检测灵敏度提升约39%。结论：本研究成功构建了重组人Trx蛋白的原核表达质粒，优化了该蛋白的原核表达条件，通过高效分离与纯化，获得了高纯度、高活性的重组人Trx蛋白，为Trx系统的功能研究及TrxR抑制剂的高通量筛选提供了物质基础。

关键词

Trx / 原核表达 / 亲和层析 / TrxR抑制剂筛选

基金资助

国家自然科学基金(82104011); 安徽省重点研究与开发计划(202004a07020041); 安徽省高校自然科学研究重点项目(2024AH051913); 安徽省教育厅新时代育人质量工程项目(研究生教育)(2024cxcysj178,2024xscx141)