基于PI3K/Akt介导的糖酵解研究益气解毒方缓解支持细胞能量供应功能放射损伤机制

摘要

目的 探讨电离辐射对支持细胞糖酵解能量供应功能的影响及益气解毒方的防护作用机制。方法 将60只SD大鼠按照随机数字表法分为空白组（n=24）、安多霖组（n=12）、益气解毒方低剂量组（n=12）及益气解毒方高剂量组（n=12）,分别灌胃去离子水、安多霖混悬液（0.35 g/kg）及益气解毒方高、低剂量药液（10.44、5.22 g/kg）10 mL/kg, 1次/d,连续5 d。制备相应血清，并采用高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）检测含药血清药物成分。随后，进行细胞实验：（1）将精母细胞系GC-2细胞分为正常对照组（10%空白血清）、模型对照组（10%空白血清）、不同浓度乳酸干预组（2、4、5、6、8、10、16、20 mmol/L,10%空白血清）,各组予相应血清预处理后，除正常对照组外均给予12 Gy ⁶⁰Co γ射线照射，建立GC-2细胞辐射损伤模型。电离辐射后24 h, CCK-8法检测各组GC-2细胞活率。（2）将小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞分为正常对照组（10%空白血清）、模型对照组（10%空白血清）、安多霖含药血清组（10%安多霖含药血清）、益气解毒方高剂量含药血清组（10%益气解毒方高剂量含药血清）、益气解毒方低剂量含药血清组（10%益气解毒方低剂量含药血清）,相应血清预处理后，除正常对照组外均给予12 Gy ⁶⁰Co γ射线照射，建立TM4细胞辐射损伤模型。电离辐射后24 h,通过比色法检测TM4细胞乳酸分泌、乳酸脱氢酶（LDH）活性、丙酮酸含量、磷酸果糖激酶（PFK）活性、腺苷三磷酸（ATP）含量；安捷伦XFe 96型Seahorse XF Pro细胞能量代谢分析仪检测糖酵解速率及最大糖酵解水平；免疫荧光法检测单羧酸盐转运蛋白4（MCT4）、葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）表达。（3）在实验（2）分组基础上，增设渥曼青霉素组（10%空白血清）,通过比色法检测TM4细胞乳酸分泌；免疫荧光法检测磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白表达；蛋白质印迹法检测TM4细胞磷脂酰肌醇3-激酶85 kDa调节亚基α（PI3K p85α）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt蛋白表达。结果 益气解毒方含药血清主要有效成分为绿原酸、芍药内酯苷、人参皂苷（Re、Rg1、Rg6）等。（1）与正常对照组比较，模型对照组细胞活率降低（P<0.01）;与模型对照组比较，4、5、6、8、10 mmol/L乳酸干预组细胞活率上升（P<0.05,P<0.01）,20 mmol/L乳酸干预组GC-2细胞活率降低（P<0.01）。（2）与正常对照组比较，模型对照组乳酸含量、LDH活性及MCT4表达、糖酵解速率、GLUT1表达、PFK活性、丙酮酸及ATP含量均下降（P<0.05,P<0.01）;与模型对照组比较，益气解毒方高剂量含药血清组乳酸含量、LDH活性及MCT4表达、糖酵解速率、GLUT1表达、PFK活性、丙酮酸含量、ATP含量均上升（P<0.05,P<0.01）。（3）与正常对照组比较，模型对照组及渥曼青霉素组乳酸含量、p-Akt降低，模型对照组PI3K p85α蛋白表达及p-Akt/Akt比值均降低（P<0.05,P<0.01）;与模型对照组比较，益气解毒方低剂量含药血清组乳酸含量及p-Akt表达上升（P<0.01）。结论 电离辐射通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信号通路，下调糖酵解关键酶/蛋白GLUT1、PFK、LDH、MCT4的表达与活性，损害支持细胞糖酵解能力及乳酸分泌功能，导致生精细胞能量供应不足；而益气解毒方可通过激活PI3K/Akt通路，恢复支持细胞葡萄糖摄取、糖酵解能力及能量供应。

关键词

糖酵解 / 电离辐射 / 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B / 支持细胞 / 益气解毒方 / 大鼠 / 细胞

基金资助

国家自然科学基金项目(No.12075035,No.82205225)