六味地黄丸调控小胶质细胞自噬干预阿尔茨海默病的体外研究

摘要

目的 探究六味地黄丸干预阿尔茨海默病(AD)的作用机制。方法 采用随机数字表法将20只SD大鼠分为空白血清组和含药血清组，每组10只。含药血清组大鼠灌胃六味地黄丸(1.18 g/kg),空白血清组大鼠灌胃等体积生理盐水，每日2次，连续5 d,制备六味地黄丸含药血清及空白血清。将BV2细胞(小鼠小胶质细胞系)、N2a/APP695swe细胞(小鼠脑神经瘤细胞系，转染APP695swe基因)共培养，分为：载体对照组、糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)过表达组、阴性对照组、GPNMB敲低组，探究GPNMB对共培养体系的作用；空白血清组、含药血清组、阴性对照-含药血清组、GPNMB敲低-含药血清组，探究六味地黄丸含药血清对共培养体系的作用及机制。采用慢病毒转染方法，以相应慢病毒转染BV2细胞48 h,再以相应血清干预BV2细胞24 h后，与N2a/APP695swe细胞共同接种至共培养体系。采用超高效液相色谱-串联质谱法分析六味地黄丸含药血清主要成分；CCK-8法筛选六味地黄丸含药血清最优体积分数；实时荧光PCR和蛋白质印迹法检测GPNMB敲低慢病毒转染效果；酶联免疫吸附测定法检测N2a/APP695swe细胞上清液β-淀粉样蛋白(Aβ)含量；CCK-8法检测N2a/APP695swe细胞增殖率；蛋白质印迹法检测BV2细胞GPNMB、解整合素样金属蛋白酶10(ADAM10)、苄氯素1(Beclin1)、泛素结合蛋白p62、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/Ⅰ(LC3-Ⅱ/Ⅰ)蛋白表达。结果 六味地黄丸含药血清的主要成分为小红参醌丙、山茱萸新苷、大黄酸、D(-)-酒石酸、法巴森、7-去羟基连苯三酚-4-羧酸、覆盆子苷F1、环(苯丙氨酸-亮氨酸)二肽、6-甲腺苷、丹参素。六味地黄丸含药血清最优体积分数为10%。与阴性对照慢病毒转染的BV2细胞比较，GPNMB敲低慢病毒转染的BV2细胞GPNMB mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。与载体对照组比较，GPNMB过表达组N2a/APP695swe细胞上清液Aβ含量降低，N2a/APP695swe细胞增殖率升高，BV2细胞ADAM10及Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高，p62蛋白表达降低(P<0.05);与阴性对照组比较，GPNMB敲低组N2a/APP695swe细胞上清液Aβ含量升高，N2a/APP695swe细胞增殖率降低，BV2细胞ADAM10、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低，p62蛋白表达升高(P<0.05)。与空白血清组比较，含药血清组和阴性对照-含药血清组N2a/APP695swe细胞上清液Aβ含量降低，N2a/APP695swe细胞增殖率升高，BV2细胞GPNMB、ADAM10、Beclin1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高，p62蛋白表达降低(P<0.05);与含药血清组和阴性对照-含药血清组比较，GPNMB敲低-含药血清组N2a/APP695swe细胞上清液Aβ含量升高，N2a/APP695swe细胞增殖率降低，BV2细胞GPNMB、ADAM10、Beclin1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低，p62蛋白表达升高(P<0.05)。结论 六味地黄丸通过调控GPNMB表达提高小胶质细胞自噬水平，进而清除Aβ沉积，发挥改善AD的作用。

关键词

六味地黄丸 / 糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B / 自噬 / 小胶质细胞 / 阿尔茨海默病

基金资助

国家自然科学基金面上项目(No.82374166); 辽宁省教育厅基本科研项目-面上项目(No.LJKMZ20221317); 辽宁省教育厅基本科研项目(No.LJ212410162052)