截断逆挽方调控AMPK改善HepG2细胞线粒体损伤的机制

摘要

目的 探讨截断逆挽方含药血清对D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导的人肝癌细胞株G2型(HepG2细胞)线粒体功能的保护作用及对单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)介导的线粒体质量控制(MQC)的调控作用。方法 将20只Wistar雄性大鼠随意分为空白对照组和截断逆挽方含药血清组，每组10只。截断逆挽方含药血清组给予截断逆挽方(21.7 g/kg)灌胃，空白对照组给予生理盐水灌胃，灌胃3 d。腹主动脉取血制备截断逆挽方含药血清及空白对照血清。综合评估细胞活力、线粒体损伤指标及MQC通路蛋白表达水平以筛选截断逆挽方的最优体积分数。将HepG2细胞分为对照组、D-GalN组、二甲基亚砜(DMSO)组、AMPK抑制剂组、截断逆挽方含药血清组、截断逆挽方含药血清加AMPK抑制剂组，分别给予对应的药物干预。使用CCK-8法检测细胞活力，荧光探针JC-1检测线粒体膜电位，荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)水平，WST-8法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性，TBA法检测丙二醛(MDA)含量等线粒体损伤指标，蛋白免疫印迹法检测磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPK、过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体融合蛋白2(MFN2)、动力蛋白相关蛋白1(DRP1)等MQC通路蛋白表达水平。结果 5%截断逆挽方含药血清对D-GalN诱导的HepG2细胞的细胞活力、线粒体损伤指标及MQC通路蛋白表达的恢复最明显，后续实验选择5%截断逆挽方含药血清干预。与对照组比较，D-GalN组、DMSO组、AMPK抑制剂组的细胞活力和SOD活性下降(P<0.01),线粒体膜电位异质性、ROS、MDA含量上升(P<0.01),p-AMPK、PGC-1α、NRF1、TFAM、MFN2蛋白表达降低(P<0.01),DRP1蛋白表达降低(P<0.01);与DMSO组比较，截断逆挽方含药血清干预后，细胞活力和SOD活性上升(P<0.01),线粒体膜电位异质性、ROS、MDA含量下降(P<0.01),p-AMPK、PGC-1α、NRF1、TFAM、MFN2蛋白表达升高(P<0.01),DRP1蛋白表达降低(P<0.01);与截断逆挽方含药血清组比较，截断逆挽方含药血清加AMPK抑制剂组的细胞活力下降(P<0.01),线粒体膜电位异质性、细胞内ROS水平上升(P<0.01),MDA含量上升(P<0.05),SOD活性下降(P<0.05),p-AMPK、PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表达降低(P<0.01),MFN2蛋白表达降低(P<0.05),DRP1蛋白表达升高(P<0.01)。结论 截断逆挽方含药血清可能通过调控AMPK介导的MQC恢复线粒体功能改善D-GalN诱导HepG2细胞线粒体损伤。

关键词

截断逆挽方 / 肝细胞损伤 / 线粒体质量控制 / 单磷酸腺苷激活的蛋白激酶 / 慢加急性肝衰竭

基金资助

国家自然科学基金项目(No.82074237,No.81573767); 北京市中医药科技发展基金项目(No.JJ-2020-51)