督脉推法激活PI3K/AKT信号通路改善孤独症谱系障碍大鼠行为学的机制研究

摘要

目的 观察督脉推法对丙戊酸(VPA)诱导的孤独症谱系障碍(ASD)大鼠行为学的影响，并采用前额叶转录组学测序(RNA-Seq)技术研究督脉推法对ASD大鼠发生作用的潜在机制。方法 将9只受孕12.5 d的SD大鼠，按照随机数字表法选取6只腹腔注射600 mg/kg VPA进行造模，其余3只注射等体积的生理盐水。孕鼠生产后，对第21天的子代雄鼠进行三箱社交实验和旷场实验评价模型。将造模成功的VPA子代雄鼠按照随机数字表法分为模型组和推拿组，每组5只；按照随机数字表法选取注射生理盐水孕鼠的子代雄鼠5只作为空白组。空白组与模型组不做干预，运用团队自主研发的推法刺激装置对推拿组大鼠进行督脉推法刺激，2次/d,连续14 d,共计28次。干预结束后，三箱社交实验测定ASD大鼠社交指数(SI)和社交偏好指数(SPI),旷场实验测定大鼠的总路程和中心区域停留时间，埋珠实验检测大鼠刻板行为，尼氏染色检测大鼠前额叶皮层尼氏体的活性。利用RNA-Seq技术检测大鼠前额叶皮层的差异表达基因(DEGs),进行基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测DEGs,蛋白质印迹法(Western blotting)检测高富集信号通路中的相关蛋白。结果 干预前，与空白组比较，推拿组与模型组大鼠SI、SPI均明显降低，总路程和中心区域时间减少(P<0.05)。干预后，与空白组比较，模型组ASD大鼠SI、SPI活跃度降低，总路程和中心区域时间减少，埋珠数量增多，前额叶尼氏体数量减少(P<0.05);与模型组比较，推拿组大鼠SI、SPI活跃度升高，总路程和中心区域时间增多，埋珠数量减少，前额叶尼氏体数量增多(P<0.05)。前额叶RNA-Seq测序结果显示，与模型组比较，督脉推法可调节推拿组ASD大鼠前额叶皮层213个DEGs的表达，其中上调181个基因，下调32个基因，GO分析主要聚焦在细胞组分中。在KEGG富集分析中，共富集到181条信号通路，其中67条信号通路差异具有统计学意义(P<0.05),在磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路中富集最高。实验验证分析结果，RT-qPCR检测显示，与空白组比较，干预后模型组ASD大鼠转化生长因子α(TGF-α)、人表皮生长因子受体3(ErbB3)、血清/糖皮质激素调节激酶2(Sgk2)和I型胶原蛋白α2链(Col1α2)表达均下降，而肝细胞生长因子(Hgf)表达升高(P<0.01);与模型组比较，推拿组大鼠前额叶TGF-α、ErbB3、Sgk2和Col1α2表达升高，而Hgf表达下降(P<0.05),其结果与RNA-seq测序结果一致；Western blotting结果显示，与空白组比较，干预后模型组ASD大鼠大脑前额叶皮层神经调节蛋白1(NRG1)、ErbB3、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、PI3K、AKT、磷酸化nNOS(p-nNOS)、磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化AKT(p-AKT)的表达降低(P<0.05);与模型组比较，推拿组大鼠大脑前额叶皮层NRG1、ErbB3、nNOS、PI3K、AKT、p-nNOS、p-PI3K和p-AKT的表达升高(P<0.05)。结论 督脉推法能够改善ASD模型大鼠社交行为、焦虑行为、刻板行为及神经元的活性，其机制可能与PI3K/AKT信号通路的激活有关。

关键词

推拿 / 督脉 / 孤独症谱系障碍 / 行为学 / 转录组学测序

基金资助

中国博士后科学基金面上项目(No.2024M760895); 国家资助博士后研究人员计划项目(No.GZC20230784); 湖南省自然科学基金项目(No.2022JJ30434,No.2024JJ6341); 湖南省教育厅科学研究项目(No.23B0390); 湖南中医药大学本科生科研创新基金项目(No.2023BKS085)