基于CRISPR/Cas9技术建立Lepr与eNos双基因敲除的糖尿病肾病小鼠模型

摘要

目的 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立瘦素受体基因（leptin receptor,Lepr）与血管内皮一氧化氮合酶基因（endothelial nitric oxide synthase,eNos）双基因敲除（double-knockout, DKO）小鼠模型，构建晚期糖尿病肾病小鼠模型。方法 根据eNos基因制备对应的gRNA,将CRISPR-Cas9体系显微注射于C57BL/Ks （BKS）背景小鼠的受精卵内。将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部。幼鼠出生后经聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）鉴定及测序分析分选出为eNos^+/-基因型的F0代阳性小鼠，获得BKS背景下的Lepr基因杂合小鼠，即基因型为Lepr^db/m的Lepr-F0代杂合子小鼠。将eNos-F0与Lepr-F0代小鼠杂交，获得eNos^+/-/Lepr^db/m双杂合F1代小鼠，将双杂合F1代小鼠进一步交配，筛选得到Lepr与eNos双基因敲除小鼠。采用PCR法鉴定小鼠基因型，按基因鉴定结果分为野生型（wild-type, WT）组与DKO组小鼠。监测各组小鼠体质量、血糖与饮水进食量；采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测小鼠尿白蛋白与尿肌酐水平，并计算尿白蛋白排泄率；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）与过碘酸六胺银（periodic acid-silver metheramine, PASM）染色检查各组小鼠肾组织病理改变。结果 PCR检测结果显示，成功构建lepr^db/db/eNos^-/-DKO小鼠。与同窝对照组相比，DKO小鼠的体质量、血糖水平与饮水进食量均显著高于同窝对照小鼠。DKO小鼠的尿白蛋白与尿白蛋白排泄率显著高于WT小鼠。病理学结果显示，DKO小鼠的肾小球体积明显增大，系膜基质增生明显。结论 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术可成功构建lepr^db/db/eNos^-/-DKO小鼠，DKO小鼠可反映糖尿病肾病的典型表现，为深入研究糖尿病肾病的作用机制提供动物模型。

关键词

基因敲除 / CRISPR/Cas9技术 / 糖尿病肾病 / eNos / Lepr