中药单体红景天素靶向幽门螺杆菌脲酶活性中心的抑制机制及胃黏膜保护作用

摘要

目的 基于中药活性成分筛选具有抗幽门螺杆菌脲酶（Helicobacter pylori urease, HPU）活性的天然小分子化合物，系统探讨其抑制机制及对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）感染后细胞炎症与氧化应激的调节作用。方法 采用多维度筛选策略，首先基于HPU晶体结构在中药单体数据库中进行计算机虚拟筛选，结合文献计量学分析优选候选分子。随后采用改良Berthelot比色法进行体外脲酶活性抑制实验验证。通过Lineweaver-Burk双倒数曲线分析酶抑制动力学特征。利用巯基阻断剂和活性中心Ni²⁺竞争抑制剂探究抑制位点，采用AutoDock Vina 1.2.3软件进行分子对接。建立Hp感染人胃黏膜上皮细胞（human gastric mucosal epithelial cells, GES-1）模型，通过CCK-8法和乳酸脱氢酶释放实验评估化合物细胞毒性，采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测白细胞介素（interleukin, IL）-6、IL-8和IL-1β的mRNA表达水平，应用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA）荧光探针检测细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。结果 筛选结果显示，天然小分子化合物红景天素（rhodiosin, RHO）具有显著的抑酶活性，其半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC50）为（82.38±5.45）μmol/L。酶动力学分析表明RHO对HPU的抑制呈现反竞争性抑制特征，抑制常数Ki为（146.40±2.19）μmol/L,RHO-巯基/Ni²⁺-HPU相互作用实验证实其作用靶点位于HPU活性中心的巯基，分子对接显示RHO特异性结合于HPU活性口袋的Flap结构域，结合能为-8.678 kcal/mol。细胞实验表明，在80μmol/L及以下浓度范围内，RHO对GES-1无显著毒性，并能显著抑制Hp诱导的IL-6、IL-8和IL-1β mRNA过表达，同时使Hp诱导的ROS生成减少95%。结论 中药单体RHO以反竞争性抑制的形式靶向HPU活性中心的巯基位点发挥抑酶作用，并能有效缓解Hp感染引发的胃黏膜上皮细胞炎症反应和氧化应激损伤，为开发新型抗Hp治疗策略提供理论依据。

关键词

红景天素 / 幽门螺杆菌 / 脲酶 / 分子对接 / 炎症 / 氧化应激