益气清热消癥方调控LAMP-1/CTSB/NLRP3轴抑制糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡的机制研究

摘要

目的 探索益气清热消癥方对高糖(high glucose, HG)联合脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导肾小管上皮细胞焦亡的影响，揭示益气清热消癥方改善糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)状态下肾小管上皮细胞焦亡效应机制。方法 以体外培养的人肾近曲小管上皮细胞系HK-2为研究对象，以HG联合LPS刺激，CCK-8法检测HK-2细胞活性以筛选最佳造模浓度，将细胞分为正常对照组、模型组和益气清热消癥方组，通过鬼笔环肽染色检测HK-2细胞骨架形态，Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况。免疫荧光法共标溶酶体相关膜蛋白-1(lysosomal associated membrane protein-1,LAMP-1)和组织蛋白酶B(cathepsin B, CTSB),Western blotting法检测含吡啶结构域的NOD样受体家族成员3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3,NLRP3)和含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)的蛋白表达水平。并以溶酶体膜透剂LLOMe为对照药，酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法检测细胞上清中炎性细胞因子白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)蛋白表达情况，观察各组溶酶体膜通透性与细胞焦亡情况。结果 30 mmol/L葡萄糖联合10μg/mL LPS刺激24 h, HK-2细胞活性受到抑制，益气清热消癥方干预使HG联合LPS刺激的肾小管上皮细胞活性提升。与正常对照组相比，HG联合LPS刺激的肾小管上皮细胞骨架褶皱呈现多边形，应力纤维破坏，细胞凋亡水平显著增加，溶酶体膜透化，CTSB释放入胞质中，焦亡相关的NLRP3、ASC蛋白表达上调，促炎细胞因子IL-18、IL-1β表达上调。与HG联合LPS模型组相比，益气清热消癥方干预后可以稳定HK-2细胞骨架，抑制肾小管上皮细胞焦亡。益气清热消癥方能够保护溶酶体膜，抑制溶酶体膜透化造成的CTSB释放入胞质，从而抑制CTSB诱导的焦亡相关NLRP3及ASC的蛋白表达，减少细胞上清中IL-1β和IL-18的释放。结论 益气清热消癥方可以减轻DKD高糖状态造成的肾小管上皮细胞损伤，其效应机制可能是通过调控LAMP-1/CTSB/NLRP3轴抑制细胞焦亡实现的。

关键词

糖尿病肾病 / 溶酶体 / 细胞焦亡 / 炎性细胞因子 / 肾小管上皮细胞