微小RNA-10b靶向抑制Wnt9B调控小型猪牙齿早期发育稳态的机制研究

摘要

目的 探索微小RNA（microRNA, miR）-10b在小型猪牙齿早期发育稳态中的调控作用及潜在分子机制。方法 收集单独培养和与颌骨共培养的蕾状期小型猪乳磨牙胚，进行miRNA测序分析并筛选出差异表达miR-10b,实时反转录定量聚合酶链反应（real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）验证其表达差异。体外利用慢病毒载体（lentivirus vector, LV）转染牙胚间充质细胞，构建miR-10b过表达模型，采用EdU标记法和细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）检测细胞增殖能力。TargetScan、miRDB等数据库预测miR-10b潜在靶基因，并结合RNAhybrid 2.2软件分析靶基因3'-非翻译区（3'-untranslated region 3'-UTR）结合位点。构建靶基因野生型（wild type, WT）及突变型（mutant, MUT）双萤光素酶pmirGLO报告载体，双萤光素酶报告实验及RT-qPCR验证miR-10b与靶基因间的靶向调控关系。结果 测序结果显示，与牙胚单独培养组（对照组）相比，牙胚与下颌骨共培养组（实验组）中miR-10b显著上调（log₂FC=4.82,P<0.05）。RT-qPCR验证结果与测序数据一致，实验组miR-10b相对表达量为对照组的2.03±0.21倍（P<0.001）。EdU标记法和CCK-8实验结果均表明，miR-10b的过表达显著抑制了间充质细胞的增殖能力（P<0.01）。生物信息学预测显示Wnt家族成员9B （wingless-type MMTV integration site family, member 9B,Wnt9B）为miR-10b的潜在靶基因，且两者3'-UTR存在特异性结合位点。双萤光素酶实验表明，与Wnt9B-WT+mimics NC组相比，Wnt9B-WT+miR-10b mimics组萤光素酶活性显著降低（P<0.01）,而Wnt9B-MUT组差异无统计学意义（P>0.05）;RT-qPCR结果显示，miR-10b过表达可显著下调牙胚间充质细胞中Wnt9B的mRNA表达水平（P<0.01）。结论 miR-10b靶向抑制Wnt9B的表达下调牙胚间充质细胞增殖活性，进而参与小型猪牙齿早期发育过程中的稳态调控，维持颌骨-牙齿的通讯平衡，揭示牙齿发育分子机制并为再生策略提供新的理论依据。

关键词

牙齿发育 / 小型猪 / 细胞增殖 / 微小RNA-10b / Wnt家族成员9B / 牙胚间充质细胞