微波辅助离子液体提取黄檗生物碱的工艺研究

Study on the Process of Microwave-Assisted Ionic Liquid Extraction of Alkaloids from Phellodendron amurense Rupr.

摘要

采用微波辅助离子液体提取方法从黄檗树皮中提取3种生物碱（药根碱、巴马汀和小檗碱）。首先基于单因素试验考察离子液体的种类和料液比对提取效率的影响，进一步考察离子液体浓度、提取时间和温度3种因素对提取效率的影响，最终应用Box-Behnken响应面方法优化，得到最佳提取工艺，并与传统提取方法进行比较。研究结果表明，1-丁基-3-甲基咪唑嗅盐（［Bmim］［Br］）溶液对生物碱的提取效率最高，最佳提取条件为离子液体浓度为0.31 mol/L，温度为94 ℃，时间为15 min，在该条件下药根碱得率为0.047%±0.003%，巴马汀得率为0.421%±0.011%，小檗碱得率为1.150%±0.028%。与传统水加热回流法相比，提取效率分别高出9.3%、12.8%和23.6%。该研究表明，利用微波辅助离子液体提取技术可以高效地从黄檗树皮中提取生物碱，为提取黄檗中活性成分提供坚实的理论基础和实证支持。

Abstract

This study employed a microwave-assisted ionic liquid extraction method to extract three alkaloids （berberine， palmatine， and berbamine） from the bark of Phellodendron amurense Rupr.. Initially， the impact of the type of ionic liquid and liquid-to-solid ratio on extraction efficiency was investigated through single-factor experiments. Subsequently， the effects of ionic liquid concentration， extraction time， and temperature on extraction efficiency were further explored. The Box-Behnken response surface methodology was then applied to optimize and obtained the optimal extraction process， which was subsequently compared with traditional extraction methods. The research findings indicated that ［Bmim］［Br］ solution exhibited the highest extraction efficiency for the alkaloids. The optimal extraction conditions included an ionic liquid concentration of 0.31 mol/L， a temperature of 94°C， and an extraction time of 15 minutes. Under these conditions， the yields of berberine， palmatine， and berbamine were 0.047%±0.003%， 0.421%± 0.011%， and 1.150%±0.028%， respectively. Compared to the traditional water heating reflux method， the extraction efficiencies were 9.3%， 12.8%， and 23.6% higher， respectively. This study demonstrates that the use of microwave-assisted ionic liquid extraction technology can efficiently extract alkaloids from the bark of Phellodendron amurense Rupr.， providing a theoretical basis and empirical support for the extraction of active components from Phellodendron amurense Rupr..

Graphical abstract

关键词

离子液体 / 微波 / 黄檗 / 生物碱 / 响应面

Key words

ionic liquid / microwave / Phellodendron amurense Rupr. / alkaloids / response surface

0 引言

黄檗（Phellodendron amurense Rupr.）属于芸香科植物，主要分布于中国东北地区^［1］。黄檗树皮的主要生物活性成分是异喹啉生物碱等，其药理作用包括抗炎、抗衰老、抗损伤、利尿、免疫调节、抗肿瘤、抗菌和神经保护等，被用于治疗糖尿病和痢疾等各种疾病^［2-6］。提取是从植物内得到活性物质的第一步^［7］，传统的提取方法包括热回流提取、索氏提取和渗滤等^［8-10］。然而，这些方法通常需要较长的提取时间或较高的提取温度，并且提取效率常常不能达到预期。新颖的提取技术逐步被应用于从植物中提取活性成分，如超声辅助提取和微波辅助提取技术等。新技术的优点是环保、提取效率高、能耗低、溶剂消耗少及操作简便等。微波辅助提取技术可以通过微波辐射迅速增加固体基质的内部压力并诱导植物细胞破裂，加速细胞内容物向提取溶剂中的释放，从而增加提取率^［11-13］。

离子液体（Ionic Liquids，ILs）是仅由有机阳离子和无机或有机阴离子组成的盐，在室温下为液体，具有低蒸气压、低挥发性和高热稳定性的特性，因此被视为绿色溶剂^［14-15］。此外，ILs可以根据植物中目标活性成分的亲疏水性调节其分子结构，增加活性成分在提取溶液中的溶解性^［16-17］。在本研究中，将微波技术与离子液体相结合，用于从黄檗树皮中提取3种主要活性成分，包括小檗碱（BER）、药根碱（JAT）和巴马汀（PAL）。同时运用Box-Behnken响应面设计方法优化工艺参数并确定最佳提取条件。进一步将新提取技术与传统提取方法进行比较，为黄檗资源的深度加工利用提供相应的参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Hypersil ODS2色谱柱（C18，250 mm×4.6 mm， 5 μm）（大连依利特分析仪器有限公司）；微波催化合成/萃取仪（908010，美国CEM公司）。

1.2 材料

黄檗树皮购买于黑龙江省哈尔滨市三棵树药材市场；十二烷基苯磺酸钠及药根碱、巴马汀和小檗碱对照品（纯度>98%）购买于阿拉丁生物科技有限公司；乙腈和甲醇（色谱级）购买于美国天地有限公司；离子液体购买于上海成捷化学有限公司。

1.3 高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定黄檗中3种生物碱方法

1）本试验使用HPLC对目标生物碱进行检测分析^［16］，检测条件为：流动相为乙腈和水溶液（体积比为1∶1），水溶液1 L内含有1.7 g十二烷基磺酸钠和3.4 g磷酸二氢钾；进样量为5 μL；流速为1.0 mL/min；检测波长为345 nm。

2）标准曲线配置方法。称取4.68 mg药根碱对照品、6.20 mg巴马汀对照品和8.39 mg小檗碱对照品，分别装入25 mL容量瓶中，用纯水溶解并定容，采用对半稀释法进行稀释，用0.45 μm微孔滤膜过滤后按照上述色谱条件对各个质量浓度对照品溶液的峰面积进行测定，并利用软件分别绘制3种生物碱标准曲线图，计算回归方程。纵坐标为峰面积分值，横坐标为对照品溶液质量浓度。

1.4 提取液中生物碱的含量计算方法

生物碱的得率为Y，计算公式为

Y=\frac{C\times \mathrm{30}}{\mathrm{1}\mathrm{000}\times m_{\mathrm{p}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（1）

式中：Y为生物碱的提取率，%；C为生物碱的质量浓度，mg/mL；m_p为黄檗药材的质量，g；1 000为生物碱的质量由mg转化为g；30为提取液体积30 mL。

1.5 单因素考察试验方法

将黄檗树皮用粉碎机粉碎，过0.25mm筛网，烘箱烘干至恒重，作为试验原料。采用Standard Control微波模式，考查离子液体种类、料液比、离子液体浓度、微波提取时间和提取温度对生物碱得率的影响。

1.5.1 离子液体种类

研究所用的4种离子液体的结构式如图1所示。称取4组0.20 g黄檗树皮粉末，分别用1-丁基- 3-甲基咪唑溴盐（［Bmim］［Br］）、1-己基-3-甲基咪唑盐（［Hmim］［Br］）、1-辛基-3-甲基咪唑盐（［Omim］［Br］）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（［Omim］［BF₄］）离子液体水溶液作为溶剂（30 mL，0.30 mol/L），使用微波提取并控制温度为60 ℃，提取5 min，随 后使用HPLC方法对提取液中生物碱含量进行检测。

1.5.2 料液比

根据离子液体种类考察试验得到的结果，选用0.3 mol/L的［Bmim］［Br］水溶液为溶剂，进行料液比考察试验。根据料液比0.1/30、0.2/30、0.3/30、0.4/30、0.5/30 g/mL的试验安排，分别称量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g黄檗树皮粉末，加入到30 mL离子液体水溶液中。使用微波进行提取，控制温度为60 ℃，提取时间为5 min，随后使用HPLC对提取液中生物碱含量进行检测。

1.5.3 ［Bmim］［Br］浓度

根据离子液体种类筛选得到的试验结果，称取5组0.20 g黄檗树皮粉末，配置浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的［Bmim］［Br］离子液体水溶液，体积为30 mL，使用微波进行提取，控制温度为60 ℃，提取5 min，随后使用HPLC方法对提取液中生物碱含量进行检测。

1.5.4 提取时间

称取6组0.20 g黄檗树皮粉末，以30 mL、0.3 mol/L的［Bmim］［Br］水溶液为溶剂，在60 ℃下，分别使用微波提取3、6、9、12、15、18 min，随后使用HPLC对提取液中生物碱含量进行检测。

1.5.5 提取温度

称取6组0.2 g黄檗树皮粉末，以30 mL、0.3 mol/L的［Bmim］［Br］水溶液为溶剂，分别在30、40、50、60、70、80、90 ℃下使用微波提取15 min，随后使用HPLC对提取液中生物碱含量进行检测。

1.5.6 响应面试验分析

根据单因素试验结果，选取［Bmim］［Br］水溶液浓度、温度、提取时间3个自变量，设计三因素三水平响应面优化试验，以3种生物碱得率为考察指标（响应值）。效应面法设计（Box-Behnken Design，BBD）响应面设计的模型符合二次多项式方程

。（2）

式中：Y为预测的生物碱得率；β₀ 、β_i 、β_ii 、β_ij 分别表示常数项、线性系数项、二次系数项、交互系数项；X_i 和X_j 表示自变量。按照BBD的统计学要求，对各项系数进行回归分析。

1.6 对比试验考察方法

1）加热回流法。称取2组0.2 g黄檗树皮粉末，分别以30 mL、0.3 mol/L［Bmim］［Br］和30 mL水为溶剂，油浴加热90 ℃，回流10 h。

2）微波辅助提取法。称取2组0.06 g黄檗树皮粉末，分别以30 mL的水和0.31 mol/L［Bmim］［Br］水溶液为溶剂，使用微波加热，在温度为90 ℃下提取15 min。

2 结果与分析

2.1 HPLC标准曲线

按照HPLC检测条件，纵坐标A为峰面积，X为对照品溶液质量浓度（mg/mL），计算回归方程。3种生物碱的线性方程及决定系数分别为JAT的峰面积：A_JAT=6 971.4X+0.772，R²=0.999；PAL的峰面积：A_PAL=8 326.1X+8.967，R²=0.999 9；BER的峰面积：A_BER=7 122X-4.732 7，R²=0.999 8。说明3种生物碱在适当的质量浓度范围内和峰面积具有良好的线性关系。

2.2 离子液体种类筛选结果

试验结果如图2所示，图2中纵坐标表示生物碱的得率，可知相同浓度下［Bmim］［Br］水溶液对3种生物碱的得率均优于其他3种类型离子液体，［Bmim］［Br］的提取效果优于［Hmim］［Br］和［Omim］［Br］的原因是阳离子的差异，［Bmim］［Br］的碳链短、极性大，而黄檗中的生物碱在极性大的溶剂中溶解性较好。［Omim］［BF₄］由于极性较小，导致在水中的溶解度较小^［18］，对黄檗中的生物碱提取效果较差。因此，选择［Bmin］［Br］水溶液作为溶剂进行下一步提取工艺研究。

2.3 料液比对生物碱提取效率的影响

在提取工艺中，药材用量和提取液的投放比例是重要的考察因素，往往是提取液体积越大提取效率越好，但是从回收和经济角度考虑应将溶剂量控制在一定范围内。本研究试验结果如图3所示，生物碱的提取效率随着加入的黄檗药材质量增加而减小（溶剂恒定为30 mL）。虽然在药材质量为0.1 g时，得率最高，但0.1/30 g/mL与0.2/30 g/mL得率差异不大，因此，研究选择料液比为0.2/30 g/mL作为后续试验条件。

2.4 ［Bmim］［Br］水溶液浓度对生物碱提取效率的影响

进一步考察离子液体浓度对提取效率的影响，随着离子液体浓度增大，3种生物碱提取率均增加，这是由于当离子液体浓度较低时，随着离子液体浓度增加，离子液体改变水溶液极性，使得生物碱溶解性增大占了主导地位，从而提取效率增加。之后随着离子液体黏度继续增加阻碍溶剂的渗透和扩散，从而降低生物碱的提取效率^［19］。由图4可知，当离子液体浓度为0.3 mol/L时，生物碱的得率最高。

2.5 提取时间对生物碱提取效率的影响

随着提取时间增加，生物碱的提取效率升高，如图5所示。生物碱的得率在15 min内缓慢增加，在15 min时生物碱的得率最高，但在18 min条件下略有下降。得率下降的原因可能是提取时间过长导致生物碱降解^［20］。因此，选择15 min为后续优化的中心点。

2.6 提取温度对生物碱提取效率的影响

温度对天然产物提取效率的影响多为随着温度升高，溶剂渗透能力、扩散能力以及溶解性均增大。本试验结果如图5所示。随着温度升高，生物碱的得率升高，在90 ℃条件下生物碱的得率最高。当温度高于90 ℃时，3种生物碱的得率均有降低的趋势，这可能是过高的温度使提取出来的生物碱部分被分解或转化^［21］。因此，选择90 ℃为后续优化的中心点。

2.7 响应面法优化的试验结果

2.7.1 BBD模型的建立及其显著性试验

在单因素试验结果的基础上，使用软件Design-Expert 13.0，采用BBD方法建立三因素三水平的模型。对响应面进行分析，研究各因素与响应值之间以及各因素之间的相互关系，进一步优化3个独立变量（X₁［Bmim］［Br］水溶液浓度、X₂温度、X₃时间）。表1展示了Box-Behnken Design的17组试验方案和对应的生物碱的得率结果。

表2试验数据通过Design-Expert 13.0软件回归拟合处理，得到3个响应值对Y_JAT、Y_PAL和Y_BER的二次多项式回归模型为

Y_PAL=-4.38+2.24×X₁ +1.84×10^-2X₂ +0.46×X₃ +2.25×10^-3X₁X₂ -5.75×10^-2X₁X₃-1.25×10^-4X₂X₃-2.47×X₁²-8.70×10^-5X₂²-1.42×10^-2X₃²。（3）

Y_JAT=-0.50+0.41×X₁+7.47×10^-3X₂ +1.77×10^-2X₃-7.50×10^-4X₁X₂+1.50×10^-3X₁X₃-1.30×10^-5X₂X₃-0.56×X₁²-3.80×10^-5X₂²-5.63×10^-4X₃²。（4）

Y_BER=-11.69+13.25×X₁+4.38×10^-2X₂+1.38×X₃-1.83×10^-2X₁X₂-0.15×X₁X₃+1.08×10^-3X₂X₃-15.41×X₁²-2.93×10^-4X₂²-3.86×10^-2X₃²。（5）

表2为回归方程模型中3种生物碱提取率的方差分析表，由表2中模型的质量因素（F）（分别为71.61、49.03和76.05，P<0.000 1）可知，该模型显著性非常明显。失拟项不显著，表明方程在试验所选范围内，拟合性较好；根据表3的结果可知，3种生物碱的决定系数分别为R² =0.989 3、0.984 4、0.989 9，说明该模型能很好地解释试验中响应值的变化；变异系数为1.55%，1.03%，1.32%，说明试验结果的可靠性和回归模型的准确性。调和系数分别为R²_adj=0.975 4、0.964 3、0.976 9，与决定系数R² 很接近，说明响应预测值和实际值高度相关。根据上述对模型的分析，说明该模型能对黄檗中3种生物碱的提取率进行很好的预测。表中X₁和X₂项的P均小于0.01，说明X₁项和X₂项对黄檗中3种生物碱的提取率线性效果非常明显；生物碱PAL和BER二次项X₁²、X₂²和X₃²的P<0.01，JAT的二次项X₁²和X₂²的P<0.01，说明此方法对生物碱提取率的影响非常显著。

2.7.2 响应面分析及优化

根据回归方程，响应面软件生成3D响应面图，如图7所示。确定1个变量，观察2个连续变量对生物碱得率的影响的3D图。由图7可以直观地反映出各因素对得率的作用。当提取条件在合适范围内，生物碱的得率不断提高，当［Bmim］［Br］水溶液浓度在0.30~0.35 mol/L、提取温度在90~95 ℃、提取时间在15~15.5 min，3种生物碱的得率达到最高。

2.7.3 验证试验

通过对3种生物碱的提取条件进行优化，使用Design Expert 13.0对试验数据进行分析，BBD模型给出提取生物碱的最佳条件，最佳提取条件是提取液浓度为0.31 mol/L，温度为94.10 ℃，时间为15.34 min，估测的最佳JAT得率为0.049%，PAL的得率为0.424%，BER的得率为1.170%。稍加修改获得的最佳条件，统一生物碱提取条件，最终使用浓度是0.31 mol/L，温度是94 ℃，时间是15 min，重复进行3次试验来保证试验的准确性并通过实际得到的生物碱得率验证模型优化得出的提取条件是否可靠。3次试验的平均值分别为JAT得率0.047% ± 0.003%，PAL得率0.421% ± 0.011%，BER得率1.150% ± 0.028%，这些结果与BBD模型估测的理论值保持一致，这说明该模型对生物碱提取方法的优化是可靠的。

2.8 与其他提取方法的比较结果

将微波辅助离子液体提取方法与传统水溶剂加热回流法进行对比。试验结果见表4。以加热回流为提取方法，［Bmim］［Br］的提取效果优于水溶液，这是由于离子液体可以改变溶剂的极性，从而增加对提取物溶解能力，提高提取率。以离子液体为溶剂，分别采用加热回流和微波辅助提取技术， 2种方法的提取率接近，然而微波提取技术所需的时间约为15 min，更为高效。在微波辅助离子液体的最佳提取条件下，与传统水加热回流法相比，提取效率分别高出9.3%、12.8%和23.6%。

3 结论

本研究对黄檗的微波辅助离子液体提取工艺进行系统性研究，对比分析具有不同性质的4种离子液体提取黄檗中生物碱的提取效率，结果表明，具有短碳链和高极性的离子液体［Bmim］［Br］提取效率最高。在单因素试验基础上，使用效应面法设计对提取工艺参数进行优化。优化后的最优工艺条件为离子液体浓度为0.31 mol/L，温度为94 ℃，时间为15 min，在该条件下药根碱提取率0.047%± 0.003%，巴马汀提取率 0.421%±0.011%，小檗碱提取率1.150%±0.028%。与传统水加热回流法相比，提取效率分别高出9.3%、12.8%和23.6%。本研究结果表明，使用微波辅助离子液体提取技术从黄檗中提取生物碱，具有提取时间较短、节省溶剂以及噪声小等优点。本研究为黄檗中生物碱的提取提供坚实的理论基础和数据支撑。

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基金资助

浙江省自然科学基金项目(LQ23H300008)

中国博士后科学基金项目(2023T160582)