基于均匀试验设计的小浆果多酚体外协同抗氧化活性研究

Study on the Synergistic Antioxidant Activity of Small Berry Polyphenols in vitro Based on Uniform Design

摘要

为研究4种小浆果多酚的协同抗氧化活性，选用均匀试验设计法优化小浆果多酚协同抗氧化组合，经过统计分析和数学回归模型拟合得到最优组合——笃斯越橘多酚（D2）、红豆越橘多酚（H2）、蓝靛果多酚（L2）、蔓越莓多酚（M2）最佳质量浓度分别为42、138、172 、0 μg/mL，对DPPH自由基的实际清除率为98.07%±0.31%，接近理论期望值100%，说明模型优选的组合具有可行性。通过协同效应分析，优选组合清除DPPH自由基和羟自由基的协同效应指数（Combination Index，CI）值分别为0.57和0.64，进一步说明笃斯越橘多酚（D2）、红豆越橘多酚（H2）、蓝靛果多酚（L2）3种浆果多酚具有显著协同抗氧化效果。研究成果可为天然抗氧剂及小浆果功能产品研发提供依据。

Abstract

To study the synergistic antioxidant activity of four small berry polyphenols， including Vaccinium uliginosum L.， Vacciniumvitis-idaea L.， Lonicera caerulea L.var.edulis Turcz.ex Herd.， and Vaccinium macrocarpon Ait. （labeled as D2， H2， L2， and M2， respectively）， was studied. The uniform experimental design method was used to optimize the synergistic antioxidant combination of small berry polyphenols. After statistical analysis and mathematical regression model fitting， the optimal combination was obtained as follows： the optimal concentrations of Vaccinium uliginosum L. polyphenol （D2）， Vacciniumvitis-idaea L. polyphenol （H2）， Lonicera caerulea L. var. edulis Turcz. ex Herd. Polyphenol （L2）， and Vaccinium macrocarpon Ait. Polyphenol （M2） were 42 μg/mL， 138 μg/mL， 172 μg/mL， and 0 μg/mL， respectively. The actual clearance rate of DPPH free radicals was 98.07 ± 0.31%， which was close to the theoretical expected value of 100%， indicating the feasibility of the selected combination in the model. Through synergistic effect analysis， the combination index （CI） values of the synergistic effect index of the selected combination for clearing DPPH and hydroxyl radicals were 0.57 and 0.64， indicated that the D2， H2， and L2 had significant synergistic antioxidant effects. The research results can provide a basis for the development of natural antioxidants and small berry functional products.

Graphical abstract

关键词

小浆果 / 多酚 / 均匀试验 / 协同效应分析 / 抗氧化

Key words

Small berry / polyphenols / uniform design / synergistic effect analysis / antioxidant

0 引言

人体内氧化失衡可引起多种疾病，抗氧化化合物可以防止或减少细胞结构的氧化损伤。植物中的多酚类物质，是食源抗氧化剂的主要来源，尤其是水果和蔬菜中的多酚类物质占食源抗氧化物质的很大比重^［1］。小浆果（如笃斯越橘、红豆越橘、蓝靛果、蔓越莓和树莓等）果实中富含多酚类物质，包括花青素、原花青素、黄酮醇和酚酸等。这些化合物具有多个酚羟基，能够提供电子或氢原子与自由基反应，中断自由基链式反应，从而发挥强大的抗氧化作用。有研究表明多种抗氧化剂配伍后的抗氧化效果大多显著高于使用同等剂量的单一抗氧化剂的效果^［2-4］。小浆果中多种抗氧化成分之间可能存在协同作用，食用6种浆果提取物（野生蓝莓、野生越桔、蔓越莓、接骨木、树莓籽和草莓）的组合比食用单个浆果表现出更高的抗氧化能力^［5］。活性物质在协同（协同/加和/拮抗）抗氧化方面与其结构和质量浓度比例具有相关性^［6-7］，只有通过科学的配比，才能发挥更好的功效。多种抗氧化剂联合使用，进行科学的配伍研究时，选取科学的试验设计方法，不但可以减少试验工作量，同时也可得出科学、可靠的配方比例。均匀试验设计（Uniform Design，UD）是一种统计试验设计方法，试验点均匀分散且较正交试验次数少的特点而被广泛用于中药方剂配伍研究^［8-9］。

基于此，本研究采用均匀试验设计，通过科学配伍，研究笃斯越橘、红豆越橘、蓝靛果和蔓越莓多酚不同组合对DPPH自由基清除能力的影响，优选出抗氧化能力较强的多种小浆果多酚协同抗氧化组合，提高小浆果多酚的抗氧化能力，提升多种小浆果果实的加工利用率，为小浆果在产品开发和食品、保健品等领域的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

笃斯越橘、红豆越橘、蓝靛果购于大兴安岭超越野生浆果开发有限责任公司，蔓越莓购于抚远红海植业有限公司。XDA-6树脂购于南开大学树脂厂；抗坏血酸（vitamin C，VC）和1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）购于Sigma公司。

ALC-110电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；S-3L pH计：上海精密仪器有限公司；UV-Vis EVO300分光光度计：Thermo公司；RE-52A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；FRQ-1035ST超声波提取仪：杭州法兰特超声波科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品提取方法

4种浆果果实鲜果直接破碎后，采用超声波辅助提取工艺提取，提取溶剂为体积分数70%的乙醇，料液比为1∶10（g∶mL），提取温度设定40 ℃，提取功率150 W，提取时间30 min，提取2次，合并提取液。将提取液在48 ℃条件下，旋转蒸发浓缩后冻干得到4种浆果多酚的粗提物，分别标记为D-0（笃斯越橘多酚粗提物）、H-0（红豆越橘多酚粗提物）、L-0（蓝靛果多酚粗提物）、M-0（蔓越莓多酚粗提物）。

1.2.2 样品纯化方法

采用柱层析法，以XDA-6为介质，依次以蒸馏水、10%乙醇水溶液、40%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液为流动相进行梯度洗脱，对浆果多酚粗提取物进行分离纯化，收集不同质量浓度乙醇洗脱液，经减压浓缩、真空冷冻，得到浆果多酚冻干粉。分别标记为D1（笃斯越橘10%乙醇洗脱物）、D2（笃斯越橘40%乙醇洗脱物）D3（笃斯越橘70%乙醇洗脱物）；H1（红豆越橘10%乙醇洗脱物）、H2（红豆越橘40%乙醇洗脱物）、H3（红豆越橘70%乙醇洗脱物）；L1（蓝靛果10%乙醇洗脱物）、L2（蓝靛果40%乙醇洗脱物）、L3（蓝靛果70%乙醇洗脱物）；M1（蔓越莓10%乙醇洗脱物）、M2（蔓越莓40%乙醇洗脱物）、M3（蔓越莓70%乙醇洗脱物）。

1.2.3 总多酚含量、DPPH和羟自由基检测方法

总多酚含量参照文献［10］，采用福林酚法进行检测。分别称取4种浆果多酚粗提物和多酚纯化物的冻干粉100 mg，溶于10.0 mL蒸馏水中，备用。DPPH自由基清除率参照Blois^［11］和徐宜彬等^［12］的研究方法，分别称取阳性对照VC粉末、4种浆果多酚粗提物和多酚纯化物的冻干粉100 mg，溶于10.0 mL蒸馏水中，配成10 mg/mL溶液，然后按照梯度0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL进行稀释，配成不同质量浓度的溶液进行清除DPPH自由基能力检测。羟自由基清除率参照王化等^［13］的研究方法，分别称取阳性对照VC粉末及D2、H2、L2的冻干粉100 mg，溶于10.0 mL蒸馏水中，配成10 mg/mL溶液，然后根据需要单一组分及组合配成不同质量浓度的溶液进行清除羟自由基能力试验研究。

1.2.4 协同效应分析方法

协同效应分析基于Chou-Talalay法^［7，14］，衡量指标是协同指数（Combination Index，CI，式中记为C_I），计算公式为

C_{\mathrm{I}}=\frac{D_{\mathrm{1}}}{D_{x\mathrm{1}}}+\frac{D_{\mathrm{2}}}{D_{x\mathrm{2}}}。（1）

式中：D₁和D₂分别是达到一定效应水平（如50%抑制率，IC₅₀或EC₅₀）时，联合用药中化合物A和化合物B的实际质量浓度，本实验选择的是IC₅₀；D_x1和D_x2分别是单独使用化合物A和化合物B达到相同效应水平所需的质量浓度；C_I<1时表示协同效应（synergism），C_I=1时表示相加效应（additivity），C_I>1时表示拮抗效应（antagonism）。

1.2.5 统计学处理

采用SPSS26.0统计软件和Excel软件对数据进行回归和方差分析处理，多组间采用单因素方差分析（One Way ANOVA），数据均采用平均值±标准误（x̅±Se，n=3）表示，利用GraphpadPrism 8.2.0软件计算IC₅₀值和作图。

2 结果与分析

2.1 4种小浆果多酚组分总多酚含量

4种小浆果多酚纯化物（D1—D3、H1—H3、L1—L3、M1—M3）各组分的多酚含量均显著高于各自的粗提物（D0、H0、L0、M0）组分的多酚含量（P<0.05），如图1所示。各组分纯化产物中均为第2段（D2、H2、L2、M2）的多酚含量最高，均显著高于其他组分（P<0.05），纯度均达到了40%以上，并且D2和L2的纯度达到了50%以上。

2.2 4种小浆果多酚清除DPPH自由基能力组分优选

由图2可知，4种小浆果多酚粗提物及纯化产物清除DPPH自由基的能力，在试验选定的0.025~0.80 mg/mL均随着质量浓度的升高而升高；并且在每组中，均是第2段的多酚纯化产物（D2、E2、L2、M2）活性最高，这可能与这段纯化产物中的多酚含量高有关。后续试验中，每种小浆果均选取活性最高的这段组分进行后续研究。

2.3 4种小浆果多酚清除DPPH自由基能力的IC₅₀值比较研究

图3是以VC为对照，4种小浆果抗氧化最强活性多酚组分随着质量浓度的升高清除DPPH自由基能力的趋势图及IC₅₀值比较，由图4可知，4种小浆果第2段多酚纯化产物清除DPPH自由基的能力均显著低于VC对照组（P<0.01），说明这4种小浆果多酚纯化产物的清除DPPH自由基能力低于VC。并且在几个小浆果多酚组分中D2和H2的IC₅₀值显著低于L2和M2，说明这2种小浆果多酚的清除DPPH自由基能力要优于另外2种。几种小浆果多酚清除DPPH自由基能力由高到低的顺序为D2、H2、L2、M2。

2.4 4种小浆果多酚组分协同抗氧化能力组合优选

2.4.1 4种小浆果多酚组分均匀试验结果及分析

以4种小浆果第2段多酚纯化产物的IC₅₀值为基础，采用均匀试验设计，根据方开泰^［15］的四因素15水平设计，采用均匀设计表U15*（15⁷）的使用表（S=4，D=0.155 1，S表示选择的列数，D表示均匀度的偏差，使用原表的1、2、4、6列），每个因素以0为起点，每个质量浓度间隔0.005 5 mg/mL，设置15个梯度，以清除DPPH自由基能力为响应指标，研究不同组合对抗氧化能力的影响，以优选出最佳组合。15个组合的编码变量、过程变量及清除DPPH自由基的结果见表1。

利用SPSS26.0统计软件和Excel软件对研究结果进行方差和回归分析，由表2方差分析结果可见，模型回归显著性P<0.01，表明模型具有显著性，模型R²为0.947，表明模型可用。

在4个因素中笃斯越橘多酚化合物（D2）对DPPH自由基的清除率具有显著影响（P<0.05），见表3。红豆越橘多酚化合物（H2）、蓝靛果多酚化合物（L2）和蔓越莓多酚化合物（M2）3个因素对DPPH自由基的清除率均具有极显著影响（P<0.01）。

通过回归拟合，可得到各因素和清除率的回归方程为：Y = 39.546 + 48.949 × D₂ + 164.034 × H₂ + 208.018 × L₂+162.763 × M₂，式中， D₂、H₂、L₂、M₂代表D2、H2、L2、M2清除率。根据试验需求，约束目标函数最大清除率为100%，得到4个因素清除DPPH自由基的最佳组合为笃斯越橘41.50 μg/mL、红豆越橘137.79 μg/mL、蓝靛果172.20 μg/mL、蔓越莓为 0 μg/mL，比例约为（14∶46∶57∶0）（表1），即不加蔓越莓多酚时，其他3种小浆果多酚进行组合的抗氧化能力最好。有研究表明活性物质在协同（协同/加和/拮抗）抗氧化方面与其结构具有相关性。3，7-二羟基黄酮与5-羟基黄酮、6-羟基黄酮和5，6，7-三羟基黄酮联合作用时，表现为协同作用；而6-羟基黄酮与5-羟基黄酮和7-羟基黄酮表现为拮抗作用^［16］。这可能是蔓越莓多酚中的某种结构与其他3种浆果中的多酚结构发生了拮抗作用，具体是哪个结构影响了组合的抗氧化活性，有待进一步研究。

2.4.2 优化结果验证

为进一步验证方程得到的质量浓度配比是否具有可行性，采用确定的优化条件进行3次平行试验，同时考虑到实际操作的情况，调整最佳组合质量浓度为：笃斯越橘多酚（D2）42 μg/mL、红豆越橘（H2）138 μg/mL；蓝靛果（L2）172 μg/mL，进行复配验证试验，此组合实际验证结果清除率为98.07%± 0.31%。

通过计算预测值与实际值的相对偏差，也可作为回归方程拟合程度的判断，公式为X_相对偏差=\left|(Y_{\mathrm{实际}\mathrm{值}}-Y_{\mathrm{预测}\mathrm{值}})/Y_{\mathrm{实际}\mathrm{值}}\right|×100%。本研究实际值与目标推测值100%比较偏差为1.93%，结果小于5.0%，相对偏差较小，说明结果较为准确，可以较好地反映实际情况，此模型具有可行性。因此，采用均匀试验设计得到的最佳组合条件准确可靠，具有实用价值。

2.5 协同效应分析

以常用抗氧化剂VC为对照，以优选出的组合处理组总质量浓度0.352 mg/mL为实验质量浓度，通过对相同物质含量的组合及单一组分进行清除DPPH自由基和羟自由基对比研究，结果如图4所示，研究发现优选出的组合清除DPPH自由基和羟自由基的能力极显著高于D2、H2、L2单一组分（P<0.01），其IC₅₀值也极显著低于D2、H2、L2单一组分（P<0.01），说明笃斯越橘多酚（D2）、红豆越橘多酚（H2）、蓝靛果多酚（L2）3种物质组合抗氧化能力具有协同增效的作用，并且通过组合之后其清除DPPH自由基的抗氧化能力显著高于VC对照组（P<0.01），清除羟自由的能力与VC对照组无显著差异（P>0.05）。

协同效应分为协同、拮抗、加和3种。有研究表明活性物质在协同（协同、加和、拮抗）抗氧化方面与其质量浓度比例具有相关性。绿原酸与芦丁浓度比值为4.5∶1时，对超氧阴离子清除能力表现为协同作用，而当两者浓度比值为1∶2时，则表现出拮抗作用^［17］。为了进一步验证均匀试验优化出的最佳组合是否具有协同增效作用，利用协同效用方程对均匀试验优化出的最佳组合进行协同效应分析，当CI值小于1，表明2种（或2种以上）物质间具有协同增强作用，并且当CI小于0.7时，表示协同作用非常显著^［18］，经协同效应分析（表4），均匀试验优化出的最佳组合清除DPPH自由基的CI值为0.57，清除羟自由基的CI值为0.64，这表明3种小浆果多酚通过适宜配伍，在抗氧化方面具有显著的协同增效作用。

3 结论

本研究采用均匀试验设计方法，优化出了几种小浆果多酚抗氧化能力的最佳配伍组合：笃斯越橘多酚（D2）∶红豆越橘（H2）∶蓝靛果（L2）为14∶46∶57，其最佳质量浓度分别为42、138、172 μg/mL，其抗氧化能力达到了98.07%±0.31%，与预测值比较偏差为1.93%，结果小于5.0%，相对偏差较小，说明结果较为准确，通过均匀试验得到的模型具有可行性。通过协同效应分析，优选出的组合清除DPPH自由基和羟自由基的协同效应指数CI值分别为0.57和0.64，表明优选出的组合在体外抗氧化活性方面具有显著的协同增效作用。随着协同抗氧化剂的研究不断深入，其在提高抗氧化能力和预防疾病方面具有很大的潜力，后续研究将进一步探索其作用机制。

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基金资助

“十四五”国家重点研发计划(2022YFD1600502-16)

黑龙江省省属科研院所业务费专项(ZNBZ2022ZZR09)

黑龙江省科学院研究基金项目(KY2023ZR05)