聚乙烯吡咯烷酮抑制蒙古栎组培褐化效果及其生理响应

Inhibiting Effect of PVP on Tissue Browning of Quercus mongolica and Its Physiology Response During Culture

摘要

为降低蒙古栎（Quercus mongolica）组培过程褐化现象，阐明褐化发生是否与抗氧化酶系统及酚类物质产生有关。以蒙古栎成熟合子胚为材料，利用组织培养技术优化蒙古栎再生植株体系获得再生植株，探究聚乙烯吡咯烷酮（PVP）抑制褐化处理对蒙古栎合子胚萌发的生理生化指标的影响。结果表明，PVP 40(40代表PVP平均分子量范围)抑制褐化效果最佳，添加0.2 g/L PVP 40不定芽诱导率最高，为71.17%，其芽增殖系数为3.90，芽生根率为40.37%，移栽存活率为73%;PVP降低了蒙古栎外植体抗氧化酶、多酚氧化酶活性及总酚酶活力，有效抑制褐化现象。PVP有效降低蒙古栎组培褐化效果抑制褐化不再加剧，优化蒙古栎器官再生植株体系，分析PVP抑制褐化处理对蒙古栎合子胚萌发的内在生理机制，为栎属其他树种抑制褐化提供参考。

Abstract

In order to reduce the browning phenomenon of Quercus mongolica during tissue culture， it was clarified whether the browning was related to the production of antioxidant enzyme system and phenolic substances. Mature zygotic embryos of Q. mongolica were used as materials， and the regeneration plant system of Q. mongolica was optimized by tissue culture technology to obtain regenerated plants. The effects of PVP on the physiological and biochemical indexes of zygotic embryo germination of Q. mongolica were investigated. The results indicated that PVP 40 had the best effect on inhibiting browning （40 represents the average molecular weight range of PVP）. The highest induction rate of adventitious buds was 71.17% when 0.2 g/L PVP 40 was added. The bud proliferation coefficient was 3.90， the rooting rate was 40.37%， and the transplanting survival rate was 73%. PVP reduced the activity of antioxidant enzymes， polyphenol oxidase and total phenolase activity of Quercus mongolica explants， and effectively inhibited browning. This study effectively reduced the browning effect of tissue culture of Q. mongolica and no longer aggravated the browning inhibition， optimized the organ regeneration plant system of Q. mongolica， and analyzed the internal physiological mechanism of PVP inhibition browning treatment on the germination of zygotic embryos of Q. mongolica， so as to provide reference for other species of Q. mongolica to inhibit browning.

Graphical abstract

关键词

蒙古栎 / 聚乙烯吡咯烷酮 / 褐化 / 植株再生 / 生理生化

Key words

Quercus mongolica / polyvinyl pyrrolidine / browning / plant regeneration / physiological biochemistry

0 引言

蒙古栎（Quercus mongolica）又名蒙栎、柞栎、柞树，为壳斗科（Fagaceae）栎属（Quercus）落叶乔木，是东北地区重要的阔叶树种，具有极高的生态和经济价值^［1-3］ 。蒙古栎主要靠种子繁殖，由于种子繁育周期性强、发芽率低，易遭受虫害且繁殖速度慢，而扦插、嫁接等传统的无性繁殖技术无法满足蒙古栎优良植株快速规模化繁殖需求^［4］。因此利用组织培养技术既可能保证其优良性状，又可以缩短培育周期，提高产量和成活率。

国内外先后对栎类树种进行了组织培养技术研究，麻栎（Q. acutissima）^［5］、栓皮栎（Q. variabilis）^［6］、北美红栎（Q. rubra）^［7］和冬青栎（Q. ilex）^［8］等多树种已成功通过组织培养技术建立再生植株体系，获得再生植株。在蒙古栎器官发生途径的植株再生研究中，基部愈伤化、植株玻璃化、培养物褐化及坏死等皆是影响其不定芽诱导及生根效率的原因^［9］。蒙古栎与胡桃楸（Juglans mandshurica）^［10］、核桃（Walnut）^［11］等阔叶树种在组培过程中的褐化现象较其他木本植物更易发生，在蒙古栎合子胚萌发培养阶段，发现褐化严重影响合子胚的萌发率。已知添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可通过控制酚类物质的产生或降低外植体死亡率来改善这些情况的发生^［12］，杨旭风等^［13］证明了丙二醛（MDA）含量过高对细胞具有毒害作用，主要影响植物细胞中超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的活性，进而导致植物组织内活性氧动态失衡，激发过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性，催化大量酚类物质转变成醌类物质导致褐化，地涌金莲（Musella lasiocarpa）等植物在组织培养中褐化加重时PPO活性和总酚酶活力均较高^［14］。然而蒙古栎组培过程褐化现象是否与抗氧化酶系统及酚类物质产生有关尚需研究。

本研究探究了不同类型PVP对蒙古栎合子胚萌发及无菌苗茎段的不定芽诱导、不定芽增殖和生根培养的影响，通过分析PVP对蒙古栎合子胚萌发及组培抑制褐化处理的内在生理机制，降低外植体褐化率，建立高效稳定、重复性良好的蒙古栎器官发生再生体系，为栎属其他树种抑制组织培养过程中的褐化现象提供参考，为今后应用蒙古栎组织培养技术并利用分子手段进行遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料取自东北林业大学哈尔滨市城市林业示范基地，于2022年9月中上旬采集棕色或红棕色的蒙古栎成熟种子并分装，挑选无虫眼的成熟种子放置在4 ℃冰箱储存备用。

1.2 外植体制备与消毒

将种子在流水下冲洗2 h去除表面杂质，在超净台内去除壳斗和种皮，用75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗3次，选择2%次氯酸钠（NaClO）和1%氯化汞（HgCl₂）分别浸泡消毒7、10、20 min，后用无菌水清洗5次，灭菌过程震荡或搅拌使外植体与消毒液充分接触。在超净工作台上用无菌滤纸吸干材料表面水分，将合子胚子叶朝上接种在培养基上。以1/2 MS（Murashige and Skoog）培养基为基本培养基，附加不同质量浓度的萘乙酸（NAA）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、吲哚丁酸（IBA），30 g/L蔗糖及7 g/L琼脂，灭菌前调整pH为5.8（本研究中基本培养基若未特别注明皆为1/2 MS培养基，蔗糖和琼脂质量浓度不变）。每个处理培养15个外植体，重复3次，观察并统计外植体污染率。

\mathrm{污染}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{污染}\mathrm{数}÷\mathrm{接种}\mathrm{数})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（1）

1.3 PVP抑制褐化处理与蒙古栎合子胚萌发

将消毒后的合子胚分别接种在添加PVP 30（0.2、0.4、0.6 g/L）和PVP 40（0.2、0.4、0.6 g/L）的萌发培养基（培养基制备同1.2）上（PVP 30和PVP 40中的30和40代表PVP平均分子量范围），以不添加PVP为对照，每个处理培养15个外植体，重复3次。30 d后观察统计7种不同抑制褐化处理的合子胚萌发率（%）、褐化率（%）、根系长度（cm）及根面积（cm²），根长、根面积使用根系扫描仪进行测定，重复3次，每次10个样本。

\mathrm{褐化}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{褐化}\mathrm{数}÷\mathrm{接种}\mathrm{数})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（2）

\mathrm{萌发}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{萌发}\mathrm{数}÷\mathrm{接种}\mathrm{数})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（3）

1.4 不定芽诱导培养

以萌发获得的无菌苗茎段为材料，取其茎段切成1~2 cm左右小段，沿形态学方向接种在添加PVP 40（0.2、0.4、0.6 g/L）和6-BA（0.2、0.4、0.6 mg/L）的诱导培养基（培养基制备同1.2）上。每个处理培养15个外植体，重复3次，30 d后观察并统计芽长度（cm）、不定芽数量（个）及外植体褐化情况，计算不定芽诱导率（%）。

\mathrm{不定}\mathrm{芽诱}\mathrm{导率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{诱导}\mathrm{数}÷\mathrm{接种}\mathrm{数})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（4）

1.5 不定芽增殖培养

将诱导获得的不定芽转移到增殖培养基上培养，培养基中添加0.2 g/L PVP 40与不同质量浓度的6-BA（0.2、0.4、0.6 mg/L），观察6-BA质量浓度对不定芽增殖的影响。每个处理培养15个外植体，重复3次，30 d后观察统计蒙古栎不定芽生长情况及增殖系数。

\mathrm{增殖}\mathrm{系数}=\mathrm{再生}\mathrm{芽总}\mathrm{数}÷\mathrm{接种}\mathrm{芽数}。（5）

1.6 生根培养与炼苗移栽

将增殖后生长良好的组培苗转入生根培养基，分别在培养基中添加不同质量浓度的NAA（0.1、0.25、0.5 mg/L）和IBA（0.1、0.25、0.5 mg/L），每个处理培养10个外植体，重复3次，培养初期暗培养 7 d后转到正常光照培养，2周后观察统计幼苗生根率及生根情况。

炼苗和移栽：选择生长良好、根系健壮的组培苗，揭开培养瓶封口膜并放置在培养室内环境下， 7 d后置于温室内炼苗移栽，清洗干净幼苗根系上残留的培养基，移栽至草炭土∶蛭石∶珍珠岩体积比例为2∶1∶1的营养基质上，选择弱光下培养，光照时间16 h/d，培养温度为25 ℃±0.5 ℃，定期浇水保持基质的含水率为50%~60%，2周后统计再生植株的成活率。

\mathrm{生根}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{生根}\mathrm{苗数}÷\mathrm{接种}\mathrm{数})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（6）

\mathrm{成活}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{成活}\mathrm{数}÷\mathrm{移栽}\mathrm{数})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（7）

1.7 PVP抑制蒙古栎合子胚褐化的生理生化指标测定

将消毒后的蒙古栎合子胚接种在添加PVP 30及PVP 40的萌发培养基中，以不添加PVP作为对照（CK），每个处理随机设置3个重复，每个重复接种外植体10个，萌发过程中每5 d取材1次，共取至第30 d（取材时间为0、5、10、15、20、25、30 d），将待测材料快速切碎混合均匀后液氮冷冻保存于-80 ℃冰箱内，用于不同类型PVP抑制蒙古栎合子胚褐化的生理生化指标含量的测定，每个处理设置3个重复，每个样品质量0.1 g，每个指标共63个样品，8个指标共504个样品。

可溶性糖、可溶性淀粉含量采用蒽酮比色法，可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法^［15］；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑NBT还原法^［16］；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚比色法^［15］；过氧化氢酶（CAT）活性采用过氧化氢法^［16］；多酚氧化酶（PPO）活性采用邻苯二酚法，总酚（TP）酶活力测定采用福林酚法^［15］。

1.8 数据分析

所有试验数据经 Excel 2010整理统计后，利用SPSS Statistics 22.0使用单因素方差分析（ANOVA）、最小显著性差异法（LSD）和邓肯（DUCAN）多重比较分析不同PVP处理组合下蒙古栎合子胚萌发率、褐化率、不定芽诱导率、增殖率、生根率及蒙古栎合子胚萌发的酶活性等生理指标的显著性差异，在P=0.05水平上进行显著性检验，百分数数据在统计分析前先进行反正弦转换，方差分析结果以均值±标准差（\overline{x}\pm s）表示，采用不同小写字母表示P<0.05水平下的差异性显著；图像均用Origin软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 消毒剂及消毒时间对蒙古栎合子胚消毒效果的影响

消毒剂及消毒时间对蒙古栎合子胚消毒效果差异显著，见表1。2种消毒剂对蒙古栎合子胚消毒效果差异显著，1% HgCl₂消毒效果优于2% NaClO。随着消毒时间的增加，污染率及褐化率下降，萌发率显著升高。因此，选择1% HgCl₂作为蒙古栎合子胚消毒剂，消毒时间20 min。

2.2 PVP抑制褐化处理对蒙古栎合子胚萌发的影响

蒙古栎成熟种子平均长2.16 cm、宽1.31 cm，单粒质量3.59 g。不同类型PVP抑制蒙古栎合子胚褐化效果差异显著，见表2。由图1可知，与对照组相比，培养基中添加PVP可以降低蒙古栎合子胚褐化率，PVP质量浓度提高褐化率随之降低，最低为31%。PVP 40较PVP 30抑制褐化效果差异显著 （P<0.05），当PVP 40质量浓度为0.4 g/L时，萌发率最高73.8%，根系长度为8.04 cm，根面积为10.39 cm²，高质量浓度的PVP不利于蒙古栎合子胚萌发。因此，添加0.4 g/L PVP 40对蒙古栎合子胚萌发抑制褐化效果最佳。

2.3 不同质量浓度PVP及6-BA组合对蒙古栎不定芽诱导的影响

不同质量浓度PVP及6-BA组合对蒙古栎不定芽诱导效果不同，见表3及图2。对照组不定芽启动时间晚，不定芽数量少、褐化率高；随着6-BA质量浓度增加不定芽诱导率提高，质量浓度为0.2 mg/L时最高，为71.17%，芽生长健壮；褐化率随PVP质量浓度提高显著下降。综上，添加0.2 g/L PVP 40与0.2 mg/L 6-BA的培养基为蒙古栎不定芽诱导的最适培养基。

2.4 6-BA质量浓度对蒙古栎不定芽增殖的影响

将诱导培养30 d的不定芽转移到增殖培养基上，6-BA质量浓度对不定芽增殖效果显著，见表4及图3。添加0.6 mg/L 6-BA增殖系数最高，为4.2，但多数叶片不舒展，出现轻微玻璃化。6-BA质量浓度为0.4 mg/L时，芽长势良好，平均苗高3.90 cm，茎段生长健壮。随着6-BA质量浓度逐渐升高，不定芽增殖系数增大，腋芽萌动较快，但叶片出现玻璃化，高质量浓度的生长素不利于不定芽增殖。

2.5 蒙古栎不定芽生根及炼苗移栽

NAA和IBA对蒙古栎不定芽生根效果的影响差异显著（P<0.05），添加NAA不定芽生根效果优于添加IBA的培养基，见表5及图4，添加0.25 mg/L NAA生根率最高为40.37%。添加IBA（0.01、0.25 mg/L）根黄白色较短、无须根；添加NAA（0.25 mg/L），根系较为粗壮。暗培养7 d后，生根效果有所增加，但叶片开始轻微发黄，随着NAA与IBA质量浓度（0.5 mg/L）的增加生根率下降，基部少量愈伤化，分化出的根系细弱相对较短，且不再继续生根，表明单一较高质量浓度的植物生长调节剂会抑制蒙古栎不定芽生根的效果。

将已生根30 d的蒙古栎茎段，选择生长健壮的幼苗进行炼苗3 d，炼苗移栽后的小植株，移栽到草炭土∶蛭石∶珍珠岩=2∶1∶1的营养基质中进行驯化培养（图4（g））。培养2周后，统计蒙古栎再生植株的存活率为73%（图4（h））。

2.6 PVP抑制褐化处理对蒙古栎合子胚萌发的生理生化影响

2.6.1 PVP抑制褐化处理对蒙古栎合子胚萌发的可溶性糖、可溶性淀粉、可溶性蛋白质量分数的影响

淀粉、糖作为储能物质为植物生长代谢活动提供物质能量，不同类型PVP抑制褐化处理对蒙古栎合子胚萌发的营养物质质量分数的影响差异显著，如图5所示。本研究中CK与PVP 30处理组的可溶性糖质量分数呈上升下降趋势，PVP 40变化趋势不规则（图5（a））。第0~10天处理组可溶性糖质量分数均高于对照组，第10天达到峰值，PVP 40处理组最高，为62.87 mg/g。可溶性淀粉质量分数均呈上升趋势（图5（b））；除第10~20天，PVP处理组可溶性淀粉质量分数均高于CK，PVP 40处理组质量分数第30天达到最大值，为56.64 mg/g。处理组与CK可溶性蛋白质量分数呈现上升趋势，在整体培养周期内差异不显著（图5（c））；处理组在培养周期末质量分数达到最大值，PVP 30可溶性蛋白质量分数为27.23 mg/g，PVP 40质量分数为27.42 mg/g。

2.6.2 PVP抑制褐化处理对蒙古栎合子胚萌发的酶活性及总酚酶活力的影响

不同类型PVP抑制褐化处理对蒙古栎合子胚萌发的酶活性及总酚酶活力影响差异显著（P<0.05）。处理组抗氧化酶活性先上升后下降，如图6所示。PVP处理组与对照组SOD活性差异显著，处理组均低于对照组，未添加PVP处理的合子胚在接种5 d时SOD 活性达到高峰，为16.69 U/g（图6（a））。除第10~20天对照组POD活性显著高于PVP处理组，对照组POD活性第10天最高，为77.75 U/g，PVP 40第10天时最高，为54.76 U/g，添加PVP能够降低POD活性。PVP处理下蒙古栎合子胚CAT活性低于对照差异显著，PVP 30与PVP 40在第10天达到峰值，分别为24.72、26.40 U/g，对照组CAT活性呈现波动式变化，可能是培养基成分及合子胚萌发过程的差异性造成的。

外植体培养第15天和第25天恰好是外植体褐化严重的时期。PVP处理组的蒙古栎合子胚PPO活性显著低于对照（图6（d））；在第25天褐化情况加重；PPO活性小范围上升，PVP 40始终处于较低水平。PVP处理蒙古栎合子胚萌发的总酚酶活力变化差异显著；对照组总酚酶活力高于PVP处理组，PVP处理组呈波动式变化，总酚酶活力越高褐化现象越严重。添加PVP可以抑制蒙古栎成熟合子胚中酚类物质的产生，从而抑制蒙古栎成熟合子胚褐化。

3 讨论与结论

在植物组培中，外植体褐化现象严重阻碍组织培养的顺利进行，本研究通过添加2种类型的PVP抑制蒙古栎合子胚萌发褐化效果，萌发培养基中添加0.4 g/L PVP 40抑制褐化效果最佳；0.2 g/L PVP 40促进蒙古栎茎段不定芽诱导及增殖，不定芽增殖系数3.90，芽生长健壮；NAA和IBA均能诱导不定芽生根，0.25 mg/L NAA生根效果最好，生根率40.37%，这与刘晓红等^［17］对地被小菊（Chrysanthemum morifolium）的研究结果一致。蒙古栎组培苗移栽存活率为73%；添加PVP处理合子胚萌发过程营养物质质量分数有所提高，酶活性及总酚酶活力显著降低，表明PVP抑制外植体褐化效果从而提高植物新陈代谢能力，促进生长发育，PVP 40对萌发褐化效果抑制优于PVP 30处理效果。

木本植物器官发生能否获得再生植株，通常有很多影响因素，外植体类型、母树基因型、基本培养基类型、植物外源激素和培养环境条件等^［18］。大量研究发现，单独使用细胞分裂素也可以诱导不定芽的发生^［19］，随着6-BA质量浓度逐渐升高，不定芽增殖系数增大，腋芽萌动较快，但叶片干枯玻璃化还易产生矮小芽，不利于后续生根培养^［20］，侧柏古树组织培养过程也有相同发现^［21］；相比较竖向放置，茎段横向放置不定芽生长更快，数量更多。在黄樟（Cinnamomum porrectum）的研究中发现生根前添加有机物质可以生根壮苗，暗培养生根效果有所增加^［22］。

PVP通过降低蒙古栎合子胚萌发过程中抗氧化酶活性和总酚酶活力有效抑制外植体褐化效果。PPO催化酚类物质氧化为醌类物质，PPO活性高低影响外植体褐化效果^［23］，酚类物质在被多酚氧化酶氧化之前，PVP对其进行吸附，使其不能形成醌类物质，从而抑制褐化^［24］。肖婧一等^［25］在5种抗褐化剂对草莓茎尖褐化及诱导分化研究中发现，0.5 g/L PVP抑制褐化效果最好，可起到破坏酚-酶复合物结构而达到抑制褐化的目的。外植体类型不同在组织培养过程中褐化的程度有所差别，通常生长状态健壮的外植体，褐化率会大幅度降低^［26］。综上所述，PVP能够抑制蒙古栎外植体褐化现象从而提高不定芽诱导率促进再生植株成活，本研究优化了蒙古栎组织培养再生体系，并分析了PVP抑制蒙古栎组织培养物的褐化效果及其生理响应，可为蒙古栎及其他栎属树种组织培养过程中解决外植体褐化问题提供参考。

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基金资助

国家重点研发计划(2023YFD2200103)

中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572023CT02)