偃松体细胞胚胎发生与遗传转化技术体系的建立

摘要

以偃松（Pinus pumila）未成熟种子为材料，未成熟合子胚为外植体，道格拉斯冷杉培养基（douglas Fir medium,DCR）为基本培养基，通过调节植物生长调节剂6-BA、NAA和ABA的质量浓度诱导其体细胞胚胎发生，共获得3个胚性细胞系。基于体胚发生体系，经过卡那霉素质量浓度筛选、侵染时间、共培养时间确定，最终建立适用于偃松的农杆菌介导的遗传转化体系，利用该系统成功获得偃松的抗性愈伤。结果表明，偃松体胚发生体系包括未成熟种子消毒、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织增殖、体胚诱导、萌发后培养及生根培养6个阶段。胚性愈伤组织诱导最适培养基DCR+1 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA，诱导率为1.11%；胚性愈伤组织增殖最适培养基为DCR+0.35 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，增殖倍数为3.73；体胚诱导最适培养基DCR+20 mg/L ABA，每克胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生量平均为86.67；体胚萌发后使用DCR+活性炭培养基进行生根诱导，生根率为58%；体胚生根后培养最适培养基为木本植物培养基（woody plant medium,WPM）+0.1 mg/L IBA。遗传转化最适卡那霉素质量浓度为60 mg/L，最佳侵染时间为15 min，最佳侵染液菌体密度OD₆₀₀为0.4，经7 d恢复培养后，再将组织转接于含60 mg/L的卡那霉素的培养基进行筛选和愈伤增殖诱导，经DNA水平鉴定和β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucuronidase,GUS）组织化学染色验证，成功获得了转基因愈伤组织，初步建立了偃松的遗传转化体系。

关键词

偃松 / 体细胞胚胎发生 / 遗传转化 / 农杆菌介导转化 / 胚性愈伤组织 / 离体再生 / 卡那霉素筛选 / GUS组织化学染色