镉暴露对肾细胞凋亡、自噬、氧化损伤及TGF-β1/Smad3/miRNAs信号通路的影响

摘要

目的 探讨镉（Cadmium, Cd）对人胚胎肾细胞293[human embryonic kidney（HEK） 293 cell line, HEK293]细胞凋亡、自噬、氧化损伤以及转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-beta 1,TGF-β1）/Smad同源物3（SMAD3）重组蛋白（Recombinant SMAD family member 3,Smad3）/微核糖核酸（microRNAs, miRNAs）信号通路的影响。方法 用氯化镉（Cadmium chloride, CdCl₂）处理HEK293细胞6、12和24 h（model）,将不做任何处理的细胞设为空白组（control）。通过3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)检测细胞增殖，通过Annexin V-异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate, FITC）/碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）双染法检测细胞凋亡，通过水溶性四氮唑-1（Water-soluble tetrazolium salt-1,WST-1）法检测超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）活力，染色试剂盒检测细胞自噬，蛋白印迹（Western Blot, WB）检测TGF-β1和Smad3蛋白表达水平，实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测miR-21的表达。在此基础上，HEK293细胞分别用TGF-β1/Smad3通路阻断剂SIS3（CdCl₂+SIS3组）、miR-空白对照（Negative Control, NC）(CdCl₂+miR-NC组)以及miR-21 inhibitor （CdCl₂+miR-21 inhibitor组）处理48 h,检测经不同方法处理后Cd暴露HEK293细胞凋亡、自噬、氧化损伤变化，以及TGF-β1/Smad3/miRNAs信号通路相关因子的表达水平。结果 同一剂量下CdCl₂染毒HEK293细胞（模型组）增长速度呈现时间效应变化，增长速度明显变慢。Cd暴露后，模型组细胞凋亡率（83.09±5.42）%、自噬率（77.16±8.91）%以及TGF-β1、Smad3蛋白表达量均显著高于对照组，模型组细胞中SOD活力显著高于对照组（P<0.05）。阻断TGF-β1/Smad3信号通路后，SIS3组细胞凋亡率（51.32±5.32）%、自噬率（43.52±2.46）%、TGF-β1、Smad3蛋白表达量均较模型组降低，SOD活力较模型组升高（P<0.05）。下调Cd暴露HEK293细胞中miR-21的表达后，与NC组比较，miR-21 inhibitor组细胞凋亡率（46.18±4.95）%、自噬率（40.56±6.42）%、TGF-β1、Smad3蛋白表达量均显著下降（P<0.05）,SOD活力相对升高。结论 Cd暴露引起肾细胞的氧化损伤、自噬与凋亡，并表现出一定的时间依赖性。环境Cd暴露可引起TGF-β1/Smad3相关miRNA-21的表达升高而导致肾功能损伤，并且相关miRNA-21可能通过TGF-β1/Smad3通路在暴露诱导的肾细胞自噬、凋亡与氧化损伤等过程中发挥一定作用。

关键词

镉暴露 / 凋亡 / 自噬 / TGF-β1/Smad3 / 肾 / 氧化损伤