类黄酮合成关键基因MeF3H在木薯块根采后腐烂中的功能分析

Functional analysis of MeF3H，a key gene for flavonoidsynthesis，in cassava postharvest deterioration

摘要

为探究MeF3H在木薯块根采后生理腐烂（PPD）中的功能，以‘华南9号’（‘SC 9’）为试验材料，通过qRT-PCR技术分析MeF3H在叶片、叶柄、茎、脆性胚性愈伤组织（FEC）、花、腋芽、纤维根、块根及块根PPD中的表达情况，确定MeF3H的亚细胞定位，结合病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）分析MeF3H沉默后块根中类黄酮含量及块根腐烂情况。结果表明，MeF3H在腋芽及纤维根中高表达，MeF3H定位在细胞质，MeF3H基因表达及块根中类黄酮含量随着PPD程度加深而升高。qRT-PCR结果显示MeF3H沉默效率在39%~67%。MeF3H沉默后，与对照植株相比，沉默植株叶片及块根中类黄酮含量均显著下降（P<0.05），且MeF3H基因表达与块根中类黄酮含量呈显著正相关（P<0.05）。在采后储存第3天，块根超过50%的面积出现腐烂，而对照植株块根腐烂率为36.67%。综上，MeF3H表达与木薯块根中类黄酮含量及块根耐PPD能力存在显著正相关（P<0.05），MeF3H基因沉默后导致木薯块根PPD显著加速。

Abstract

In order to understand the function of MeF3H in postharvest physiological deterioration （PPD） of cassava tuberous roots， ‘South China No. 9’ variety （‘SC 9’） was used as the material. The expression of MeF3H in leaves， petioles， stems， fragility embryogenic callus （FEC）， flowers， axillary buds， fibrous roots， tuberous roots and PPD process were analyzed， and the subcellular localization of MeF3H were determined. Virus induced gene silencing （VIGS） technology was used to silencing MeF3H， and the effects on flavonoid content and PPD were analyzed. The results showed that MeF3H was highly expressed in axillary buds and fibrous roots， and MeF3H was localized in the cytoplasm， the expression of MeF3H and content of flavonoid in tuberous roots were increased with PPD process. The results of qRT-PCR analysis indicated that the silence efficiency of MeF3H was 39% to 67%. Compared with control， the flavonoid content in the leaves and tuberous roots of silenced plants were significantly decreased（P<0.05）， and there is a significant positive correlation between MeF3H expression and flavonoid content（P<0.05）. The degree of PPD was significantly deepened in silenced cassava plants， with a root degeneration rate was over 50% at 3 d after harvest， while the deterioration rate in control plant was 36.67%. In conclusion， there is a significantly positive correlation between MeF3H expression and flavonoid content， PPD tolerance of turberus roots （P<0.05）. Silencing MeF3H gene significantly accelerates PPD occurrence in cassava tuberous roots.

Graphical abstract

关键词

木薯 / 类黄酮 / MeF3H / 块根 / 采后腐烂

Key words

cassava / flavonoids / MeF3H / tuberous roots / postharvest physiological deterioration

类黄酮是植物体内广泛存在的一类重要的次生代谢物，主要包括花青素、异黄酮、黄酮醇等，影响植物观赏性、食用性以及抗逆性等^［1］。在植物遭受非生物逆境胁迫（强光、低温、干旱、机械损伤等）时，植物体内类黄酮合成相关基因被诱导表达，类黄酮尤其是花青素和原花青素在植物体内大量积累，通过清除ROS的积累，或者协同其他逆境响应因子（ABA、GA、抗氧化酶等）减缓逆境对植物的伤害进而提高植物的逆境适应性^［2］。以MYB-bHLH-WD40转录因子复合体为核心的类黄酮调控途径是深入研究并被广泛报道的调节方式^［3］。类黄酮类化合物在非生物胁迫中的功能研究对解析木薯采后生理腐烂形成与调控的机理有重要意义。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界亚热带和热带地区主要的粮食作物，在我国“一带一路”建设中发挥积极作用^［4］。木薯通常在收获后的1~3 d就开始发生变质，称之为“采后生理腐烂”（Postharvest physiological deterioration，PPD）^［5］。据统计，每年亚洲、拉丁美洲及非洲因木薯PPD所造成的经济损失分别可达8%、10%和29%^［6］。木薯PPD是由块根收获时的机械损伤引起的一系列生理生化反应，属于植物非生物逆境胁迫的一种。机械损伤可导致类黄酮化合物积累^［7］，其中柚皮苷和山奈酚可在应激反应中作为抗氧化剂抑制SOD活性^［8］，通过清除过量ROS进而提高植物对胁迫的耐受能力。目前，类黄酮化合物在木薯PPD调控中的功能研究甚少，已有研究仅证实表儿茶素可以作为PPD的标记代谢物^［9］，但具体的作用机制尚未明晰。An等^［10］通过转录组、代谢组、干扰等技术发现类黄酮代谢通路中28个基因及51种代谢物在PPD过程中高度富集，包括查尔酮合成酶（MeCHS）、花青素合成酶（MeANS）等基因和木犀草素、山柰酚、根皮素等代谢产物，证实类黄酮化合物积累可有效延缓块根PPD发生，因此，推测块根类黄酮代谢物积累抑制了机械伤害带来的ROS爆发，进而延缓块根PPD发生。黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是植物类黄酮代谢途径上的一个关键酶，可以催化柚皮素发生反应生成二氢黄酮醇，二氢黄酮醇是黄酮醇和花青素合成的共同前体物质^［11］。F3H基因作为花青素合成途径和黄酮醇合成途径中的关键基因，在许多植物中都已被克隆，如拟南芥^［12］、玉米^［13］、大豆^［14］等。近年来的研究主要集中于F3H基因在花色、果色形成中的调控作用^［15-16］，以及非生物逆境胁迫对花色素苷合成的影响^［17-18］，但目前其在木薯PPD中的功能及生理机制尚未见报道。本研究以食用木薯‘华南9号’（‘SC 9’）栽培种为研究对象，分析MeF3H在不同组织的表达及亚细胞定位，利用病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）技术沉默MeF3H，通过植株块根PPD表型观察、qRT-PCR分析及类黄酮含量测定，旨在探究MeF3H在木薯块根PPD发生过程中的生物学功能，以期为延缓木薯块根储藏期间采后生理腐烂提供新思路。

1　材料与方法

1.1　材料

木薯材料为食用木薯品种‘SC 9’，来自于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃。‘SC 9’于2022年3月种植于国家木薯种质资源圃（海南儋州，19°30′33.13″N， 109°30′19.34″ E），植后10个月的木薯块根用于PPD观察。将木薯‘SC 9’成熟茎杆分成约25 cm的茎段，扦插于装满基质（沙土∶营养土∶蛭石=4∶1∶1）的花盆中置于温室中培养，萌发后生长40 d的盆栽苗用作VIGS试验材料，检测正确的VIGS植株移至国家木薯种质资源圃种植，植后3个月块根用于PPD观察。用于亚细胞定位的野生型烟草‘本生烟’由本实验室保存。

1.2　方法

1.2.1　木薯MeF3H在不同组织和PPD中的表达

采用植物总RNA提取试剂盒（DP441，天根生化科技（北京）有限公司）提取‘SC 9’叶片、叶柄、茎、脆性胚性愈伤组织（FEC）、花、腋芽、纤维根及块根与采后贮藏0、1、3和5 d的块根总RNA，cDNA第一链的合成参照赛默飞世尔科技（中国）有限公司的Thermo Scientific RevertAid RT试剂盒（K1691）说明书进行。设计MeF3H的qRT-PCR特异引物（表1），以MeActin基因为内参，进行qRT-PCR反应，每个样品重复测定3次，使用2^-ΔΔCt法计算MeF3H的相对表达情况。参照Wilson等^［19］的木薯品种‘TME204’的基因表达图谱（http：//shiny.danforthcenter.org/cassava_atlas/）查找MeF3H（Manes. 02G104700）在不同组织的表达情况。

1.2.2　木薯MeF3H亚细胞定位

设计MeF3H的全长扩增引物（表1），以‘SC 9’叶片cDNA为模板，扩增MeF3H片段，经回收后，采用Nimble Cloning试剂盒（NC001，海南你行生物科技有限公司）将片段与pNC-Green-SubN空载体连接，具体操作过程参照Yan等^［20］。测序验证正确后的载体即为亚细胞定位所需的重组载体，测序引物见表1。瞬时转化烟草，3 d后使用激光共聚焦显微镜观察MeF3H的定位情况，具体操作过程参照An等^［21］的方法。

1.2.3　木薯MeF3H沉默片段的获得、载体构建和沉默效率检测

利用SGN VIGS在线工具（https：//vigs.solgenomics.net/）^［22］选择木薯MeF3H基因（Manes.02G104700）沉默的靶基因区域，沉默序列片段长为300 bp，根据靶基因序列设计引物（表1）。以‘SC 9’叶片cDNA为模板，扩增MeF3H沉默片段，经回收后，采用Nimble Cloning试剂盒将沉默片段与pCsCMV-NC空载体进行连接，具体操作过程参照Tuo等^［23］的方法。测序验证正确后的载体即为VIGS所需的重组沉默载体pCsCMV-MeF3H，测序引物见表1。

将空载体pCsCMV-NC与沉默载体pCsCMV-MeF3H通过热激法转入农杆菌GV3101（psoup-19）感受态细胞，PCR鉴定呈阳性的克隆菌液即为本试验所需的农杆菌单克隆。空载体pCsCMV-NC与pCsCMV-MeF3H重组载体农杆菌在带有抗性的LB培养基中培养至OD₆₀₀ 0.8~1.0，经离心、重悬后注射‘SC 9’木薯叶片背面，每个载体注射5株，具体操作参照An等^［10］方法。在侵染后的第24天，提取叶片RNA，运用qRT-PCR技术检测各植株中MeF3H的表达情况，以木薯Actin基因作为内参，使用2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量，得到各沉默株系中MeF3H基因的沉默效率。

1.2.4　类黄酮含量测定

木薯叶片及块根中类黄酮的提取，采用北京索莱宝科技有限公司（Solarbio）植物类黄酮含量检测试剂盒（BC1335）方法，按照样本质量计算各样品的类黄酮含量。

1.2.5　木薯沉默株系块根PPD鉴定

将检测正确的盆栽植株移植大田种植，3个月后收获其块根，将完整薯块储存于培养箱（26 ℃，16 h/8 h）0、1、3、5 d后观察PPD情况，方法参照Rahmawati等 ^［24］，略有改进，选取块根3个相对位置（1/4、1/2和3/4处）计算各位置变色百分比，最终获得5个样本的平均采后腐烂率。

1.2.6　数据统计分析

数据分析采用Excel 2013和DPS v7.05统计软件，差异显著性标准采用新复极差法（Duncan），相关性分析采用Pearson相关分析。

2　结果与分析

2.1　木薯MeF3H在不同组织及PPD中的表达分析及亚细胞定位

由图1可知，MeF3H基因主要在木薯腋芽和纤维根中优势表达，其中MeF3H基因在腋芽中的相对表达量为叶片的5.79倍，而在叶柄中的相对表达量仅为木薯叶片的0.31倍。瞬时表达结果表明35S：：GFP-MeF3H融合蛋白主要集中在细胞质中（图1（b）），MeF3H为细胞质定位的蛋白质。

随着木薯块根贮存时间的延长，PPD程度的加深，MeF3H的表达逐步增强。采后1、3和5 d的MeF3H相对表达量分别是0 d（CK）的3.87、7.45和10.18倍（图2（a））。同时类黄酮含量也随着PPD程度加深而显著升高（图2（b）），经过相关性分析发现，PPD过程中MeF3H基因表达量与类黄酮含量呈显著正相关（R² =0.910）。

2.2　木薯MeF3H沉默植株的获得及MeF3H在沉默植株的表达分析

由图3（a）可知，MeF3H沉默植株的新叶与对照组差异显著。对照组（pCsCMV-NC，NC）在1 040 bp处有目的条带，转化成功的沉默植株在663 bp处有目的条带（图3（b））。分别与5株对照组（pCsCMV-NC）叶片中MeF3H的表达量相比，试验组5株沉默植株MeF3H的表达量均显著下调，沉默效果最好的重复1中MeF3H的相对表达量仅为NC的0.33倍，重复3中MeF3H的相对表达量为NC的0.61倍，为沉默效率最低的重复，沉默效率达到39.0%（图3（c）），表明pCsCMV-MeF3H可以高效沉默木薯MeF3H基因的表达。

2.3　木薯MeF3H沉默植株中类黄酮含量分析

由表2可知，MeF3H沉默后的木薯叶片和块根中类黄酮含量均显著下降，与转pCsCMV-NC的植株（NC）相比，沉默的木薯叶片中类黄酮含量平均下降31.94%，沉默的木薯块根中类黄酮含量下降26.92%。MeF3H沉默植株中MeF3H基因相对表达与类黄酮含量的相关性分析表明两者存在显著正相关性（R² =0.933）。

2.4　木薯MeF3H沉默植株PPD观察

由图4（a）可知，MeF3H基因沉默效率最好的植株长势明显较弱，株高、地上部分生物量及单株鲜薯重分别为1.84 m、1.36 kg和0.85 kg，均显著低于转pCsCMV-NC（NC）植株2.08 m、1.78 kg和1.15 kg。与植株NC相比，MeF3H基因沉默植株块根PPD程度显著加重，在贮藏后第1天就出现明显的黑色斑点，在第3天超过50%的块根出现腐烂，第5天后出现微生物感染，进入次级腐烂阶段（图5和表3）。对不同储存时间处理的木薯块根采后腐烂率的观察发现沉默MeF3H基因后，块根PPD的发生提前，PPD程度加重。

3　讨论

3.1　 MeF3H基因表达特性

已有研究表明F3H基因的表达具有明显的时空和组织特异性^［25-26］，本研究发现MeF3H基因在不同木薯组织的表达量差异显著（图1（a）），MeF3H在木薯腋芽及纤维根中高表达，在叶片和块根中表达量相当，而在叶柄中相对较少，这与‘TME 204’的基因表达图谱中该基因的表达情况大致相同。同时本研究发现，MeF3H基因可能参与木薯块根的发育过程，特别是在块根发育的初期即纤维根阶段，MeF3H基因的表达较高，而在块根发育后期表达显著下降，推测其可能在木薯块根发育过程中起到负调控作用。MeF3H基因表达具有明显组织特异性，与在中间锦鸡儿^［26］、长叶红砂^［27］、藤茶^［30］等物种中的研究结果一致，与数据库中‘TME204’的MeF3H基因表达结果大致相同。

3.2　 MeF3H基因对木薯类黄酮代谢的影响

类黄酮又称黄酮类化合物，是植物中重要的多酚类次生代谢产物。不仅能调控花、果的颜色，而且在保护植物免受生物及非生物逆境胁迫方面也发挥着重要作用^［27］。类黄酮代谢始于苯丙氨酸，F3H是一种关键的结构基因，作用于类黄酮生物合成途径的分叉处，导致产生不同的类黄酮，如黄酮、黄酮醇、花青素和原花青素^［28］。F3H基因的过表达可以显著增加黄酮类化合物的生物合成^［29-30］，而阻断拟南芥F3H作用将降低其黄酮醇含量^［31］。本研究发现沉默木薯MeF3H基因后，叶片及块根中类黄酮含量显著下降，这与上述研究结果一致。抑制或过表达F3H基因，可直接导致植物类黄酮代谢合成下调或上调^{［29，31］}，在木薯中亦如此^［10］。同时对PPD过程以及沉默植株中MeF3H基因表达与类黄酮含量进行相关性分析发现两者存在显著正相关，后续可对木薯MeF3H基因进行克隆，并借助基因工程手段进一步了解其功能，为提高木薯块根黄酮类化合物含量奠定基础。

3.3　 MeF3H基因对木薯块根PPD的影响

非生物逆境胁迫可诱导F3H基因的表达，在干旱、高盐、低温胁迫下，F3H基因的表达均有上升^{［17，32-33］}。木薯块根PPD是由收获时的机械伤害引起的腐烂变质，属非生物逆境胁迫的一种。An等^［10］研究发现大部分类黄酮代谢相关基因表达随着PPD程度升高，包括MeF3H基因，这与本研究中‘SC 9’块根储存不同时期MeF3H的表达一致（图2（a）），且沉默MeF3H基因后，块根变质率显著升高（图5，表3），表明MeF3H表达量与木薯块根耐PPD能力呈显著正相关。推测木薯块根在受到机械伤害后，MeF3H可通过上调表达进而增加木薯块根中类黄酮含量，通过清除ROS，延缓木薯块根PPD的发生。MeF3H沉默株系的长势明显较弱，薯块偏小，植株整体发育受到抑制，MeF3H通过抑制木薯的发育进而影响PPD仍有待进一步解析。

4　结论

MeF3H在木薯腋芽及纤维根中高表达，MeF3H定位在细胞质，MeF3H基因表达量及块根中类黄酮含量随着块根贮藏时间的延长而逐渐升高。MeF3H沉默后，叶片及块根中类黄酮含量均显著下降，木薯块根PPD程度显著加深，在采后储存第3天块根超过50%的面积出现腐烂。MeF3H基因表达量与木薯块根耐PPD能力呈显著正相关，因此可通过过表达MeF3H基因来提高木薯块根对PPD的耐受。

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基金资助

海南省自然科学基金（320MS100）; 中国热带农业科学院基本科研业务费专项（1630032022007）