唐菖蒲蛋白磷酸酶GhPP2C1基因功能及其对ABA的响应

The function of Protein phosphatase gene GhPP2C1 in Gladiolus and the response of ABA

摘要

为探究唐菖蒲GhPP2C1（Protein phosphatase 2C1）的功能及对脱落酸（Abscisic acid，ABA）的响应，以唐菖蒲‘Rose Supreme’为试材，利用同源克隆的方法获得ABA信号转导过程中的关键蛋白磷酸酶基因GhPP2C1，利用实时荧光定量分析、亚细胞定位和启动子β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色等方法检测其对ABA的响应情况；对其启动子序列进行响应元件分析；在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因，对转基因株系进行ABA敏感性测定、株型分析及下游基因表达情况分析。结果表明：1）GhPP2C1的表达在ABA处理的诱导下显著上调。2）GhPP2C1定位于细胞质中，可被ABA处理诱导入核。3）GhPP2C1基因启动子包含ABA、赤霉素（Gibberellins，GAs）、干旱和低温相关响应元件。在烟草叶片和拟南芥根尖中，GhPP2C1启动子活性可被ABA激活。4）在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因导致ABA信号通路中下游基因的表达量显著下降并出现分枝数、株高和种荚数量明显增加的表型。综上，推测唐菖蒲GhPP2C1可能通过减弱ABA信号传导，促进种子休眠解除，且在植株营养生长过程中也发挥作用。

Abstract

In order to explore the function of GhPP2C1 （Protein phosphatase 2C1） in Gladiolus and its response to abscisic acid （ABA）， the key protein phosphatase gene GhPP2C1 in ABA signal transduction was obtained using homologous cloning method using Gladiolus （‘Rose Supreme’） as the sample. RT-qPCR， subcellular localization and promoter GUS staining were performed to detect its response to ABA. The response element of the promoter sequence was analyzed. GhPP2C1 gene was overexpressed in Arabidopsis， the transgenic lines were tested for ABA sensitivity， and downstream genes expression and phenotype were analyzed. The results were as follows： 1） The expression of GhPP2C1 was significantly upregulated by ABA treatment. 2） GhPP2C1 was localized in the cytoplasm and could be induced into the nucleus under induction of ABA treatment. 3）The GhPP2C1 promoter fragment contained some responsive elements， such as ABA， gibberellins （GAs）， dehydration and cold. The GhPP2C1 promoter activity was activated by ABA in N. benthamiana leaves and Arabidopsis roots. 4）In Arabidopsis， heterologous overexpression of GhPP2C1 resulted in a significant decrease in the expression of downstream genes in ABA signaling pathway and a significant increase in branch number， plant height and seed pod number. In conclusion， GhPP2C1 might promote seed dormancy release by participating in reducing ABA signal transduction， and might also play a role in plant vegetative growth.

Graphical abstract

关键词

唐菖蒲 / GhPP2C1 / 脱落酸 / 异源转化拟南芥

Key words

Gladiolus / GhPP2C1 / abscisic acid / heterologous transformation of Arabidopsis

休眠是植物在进化过程中形成的抵御不良外界环境的一种生存策略，也是选育园艺作物的关键性状。植物休眠得不到充分解除，直接影响后期的生长发育等过程，导致花芽无法正常分化、出现盲花、花期延迟和花葶无法伸长等问题，严重损害园艺作物的产量和经济价值^［1］。常见的休眠器官（组织）包括种子、茎尖和芽等^［2］。

唐菖蒲（Gladiolus hybridus）为鸢尾科唐菖蒲属球根植物，是世界六大切花之一^［1］。球茎是其唯一商品化繁殖材料，在国内有2种种植模式：在凌源等北方地区，露地春季种植，夏季开花，用于自然花期切花生产；在福建和广州等南方地区，秋季温室种植，春节及情人节前后收获，用于反季节切花生产。但球茎具有休眠的特性，休眠期长达2~4个月，极大地限制了周年切花生产^［3］。新鲜收获的球茎需在阴凉通风处放置1个月，再将球茎放置2~5 ℃冷库中贮藏2个月完全打破休眠后再播种^［4］。所以，探索调控唐菖蒲球茎休眠解除的分子机制，促进其休眠解除是亟待解决的问题。

脱落酸（ABA）参与植物休眠状态的建立和维持，是抑制唐菖蒲球茎休眠解除的关键内源激素^［5-6］。研究表明，在低温促进唐菖蒲球茎休眠解除过程中，GhTCP19水平升高，抑制ABA合成关键酶GhNCED基因（NINE-CIS-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE）的转录，降低了内源ABA的合成，ABA含量下降，ABA信号基因GhABI5的表达也被显著抑制^［7］。在此过程，球茎中细胞分裂素合成限速酶GhIPT基因（Isopentenyl transferases）的转录增加，细胞分裂素含量上升，诱导细胞周期蛋白基因GhCYCA3；1（CYCLOIDEA）、GhCYCB1；2和GhCYCD6的表达，促进细胞分裂，ABA与细胞分裂素拮抗调控球茎休眠解除^［7］。此外，前期研究发现GhbZIP30和GhCCCH17也参与负调控ABA代谢基因的表达，降低内源ABA含量^［8］。转录因子GhBPC2（BASIC PENTACYSTEINE 2）可参与招募组蛋白，通过表观修饰降低GhABI5位点的H3K4me3修饰和提高H3K27me3修饰水平抑制GhABI5的转录，阻断ABA的信号转导，进而促进球茎休眠解除^［9］。

2C型蛋白磷酸酶（PP2C）是可以催化丝氨酸和苏氨酸残基脱去磷酸基团的蛋白磷酸酶，在各种植物中广泛分布。如马铃薯（Solanum tuberosum L.）^［10］、香蕉（Musa nana Lour.）^［11］、棉花（Gossypium spp.）^［12］、玉米（Zea mays L.）^［13］和小麦（Triticum aestivum L.）^［14］等。PP2C可以打破休眠，促进萌发，在ABA信号转导途径中，PP2C作为负调控因子发挥作用^［15］。如在唐菖蒲球茎解除休眠的过程中，GhPP2C1负调控GhABI5的转录^［16］。此外，低温贮藏也诱导百合‘黄精’（Polygonatumsibiricum）种子中PsPP2C高表达，缩短并打破其生理休眠，促进幼苗形态建立^［17］。在水稻中过表达PP2C的K亚家族成员OsPP45可以降低水稻种子萌发和根系生长中对ABA的敏感性。OsPP45可以与OsDMI3相互作用，通过去磷酸化使OsDMI3失活，抑制ABA信号通路转导^［18］。同样，研究表明水稻中OsABI-LIKE2和OsPP2C108^［19-20］，小麦的TaPP2Ca10^［14］，玉米中A类PP2C成员ZmPP2C-A1、ZmPP2C-A2和ZmPP2C-A6都能够调控ABA介导的种子休眠^［21］，降低种子对ABA的敏感性，促进种子萌发。

近年来，GhPP2C1在唐菖蒲球茎休眠中的功能已经有了初步验证，沉默GhPP2C1抑制芽和根的伸长，抑制球茎休眠解除^［13］。但是GhPP2C1的功能及其对ABA的响应尚不完善。本研究通过同源克隆、实时荧光定量分析、亚细胞定位、启动子β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色、启动子响应元件分析和基因表达分析等方法旨在深入了解球茎休眠解除过程中GhPP2C1对ABA的响应及功能分析，以期为基因工程手段改良休眠性状和新品种选育奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料

试验材料为唐菖蒲（Gladiolus hybridus）品种‘超级玫瑰’（‘Rose Supreme’）完全休眠解除的籽球，种植于中国农业大学科学园。秋季地上部枯萎后收获地下新球茎及籽球，室温晾晒4周，转入4 ℃冷库低温处理4周，使籽球处于浅休眠，备用。

用H₂O、100 μmol ABA处理浅休眠籽球，在0、6、12、24和48 h分别取样（0.5 g新鲜重量）提取RNA，反转录后利用实时荧光定量PCR检测GhPP2C1在ABA处理不同时间下的表达水平。

用低温处理8周完全解除休眠的籽球（直径0.8~1.0 cm）诱导愈伤。籽球用75%酒精清洗1 min，用1%次氯酸钠溶液洗涤30 min，在超净工作台内用无菌蒸馏水清洗5次。将芽和根切除，球茎切成2.0~3.0 mm厚的薄片，倒置在愈伤诱导培养基（4.43 g/L MS（Murashige and Skoog）基本培养基+6 mg/L 噻苯隆（Thidiazuron）+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂（pH 5.8）），在22 ℃黑暗条件下培养约1个月。将愈伤从茎盘上切下，放置在含10 μmol ABA的愈伤诱导培养基上分别处理0、6、12和48 h并取样（0.5 g新鲜重量），液氮冷冻后在-80 ℃下储存；然后提取RNA，反转录后利用实时荧光定量PCR检测GhPP2C1在ABA处理不同时间后的表达水平。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）以哥伦比亚生态型Columbia（Col）种子为试验材料。将种子消毒（在超净工作台中用1%次氯酸钠溶液洗涤15 min，无菌水冲洗5次）后使用固体培养基（4.43 g/L MS基本培养基+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂（pH 5.8））培养，培养条件为光照16 h，光强：120~150 μmol/（m²·s），黑暗8 h，温度22 ℃。

烟草为本氏烟（Nicotinan benthamiana），将种子播种在1/2体积草炭和1/2体积蛭石的基质中，待长出2片子叶后移栽，在22 ℃，16 h光周期的温室内培养。长至六叶期，用于后续试验。

1.2　试验方法

1.2.1　总RNA的提取和GhPP2C1表达分析

使用Vazyme RC401植物总RNA提取试剂盒（富含多糖多酚）提取唐菖蒲籽球和愈伤总RNA。利用Vazyme的反转录试剂盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）获得cDNA。将反转录的cDNA模板稀释至300 ng/L，进行实时荧光定量PCR。设计GhPP2C1-qRT定量引物（表1），检测ABA处理小籽球0~48 h和愈伤0~24 h后GhPP2C1的表达情况。以GhACTIN基因（NCBI登录号：JF831193.1）作内参。荧光定量PCR反应条件和体系参考吴健^［1］方法，采用2^-∆∆Ct法进行定量数据分析。

1.2.2　克隆GhPP2C1启动子

GhPP2C1启动子的克隆采用Hightail-PCR的方法^［22］。第一轮的上游引物为LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4和LAD1-5，第二、三轮的上游引物为AC1，三轮的下游引物分别为GhPP2C1-HiR1、GhPP2C1-HiR2和GhPP2C1-HiR3。分别取第一、二轮的产物稀释40倍作为第二、三轮的模板。使用琼脂糖凝胶电泳对第二、三轮的产物进行检测，根据已知的条带大小差异，切胶回收，连接PMD18-T载体后，次日进行菌落PCR鉴定（表1），将阳性菌斑送去测序。

1.2.3　GhPP2C1的亚细胞定位

设计带有SalⅠ和SpeⅠ两个限制性内切酶位点的引物GhPP2C1-SalⅠ-F和GhPP2C1-SpeⅠ-R，以经测序矫正的pMD18-T-GhPP2C1质粒为模版，PCR扩增GhPP2C1片段。使用SalⅠ和SpeⅠ内切酶分别对PCR产物和载体pCAMBIA1300-GFP进行双酶切，利用T4-DNA连接酶连接，构建过表达载体pCAMBIA1300-GhPP2C1-GFP，并转入农杆菌GV3101中，经PCR扩增鉴定阳性克隆。挑取阳性克隆进行过夜摇菌，将菌液6 000 r/min室温离心5 min后使用重悬液（10 mmol MgCl₂、10 mmol MES pH 5.8和200 μmol Acetosyringone/AS）重悬至OD₆₀₀=0.7~0.8，与P19等体积混合黑暗静置3 h。选择生长到六叶期的本氏烟注射，2 d后将注射部位的烟草叶片用圆形打孔器取样，平铺在含在100 μmol ABA的MS培养基上，另一组平铺在MS培养基上，22 ℃黑暗培养12 h。用共聚焦激光显微镜Zeiss 710（激发光波长为488 nm）检测GFP荧光信号。

1.2.4　农杆菌介导的拟南芥转化及ABA胁迫处理

设计特异引物GhPP2C1-PRM-HindⅢ-F和GhPP2C1-PRM-SmaⅠ-R，克隆启动子片段后，构建表达载体pCAMBIA1391-GhPP2C1pro-GUS。根据吴健^［1］方法，用农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥，筛选鉴定获得转基因拟南芥植株。分别将萌发后的野生型和3个转基因纯合株系的拟南芥转移至含有不同浓度（0、0.5、1.0、3.0、50、100、150 μmol）ABA的MS培养基上，放到光照培养箱（光照16 h，黑暗8 h，温度22 ℃）内垂直培养，7 d后观察表型并统计。将筛选出的T₃代纯合体植株播种于MS培养基中，春化后将萌发7 d的转基因拟南芥植株分别浸没在2、20和200 μmol ABA溶液和H₂O中48 h后，利用吴健^［1］方法进行GUS组织化学染色。在显微镜下观察GUS表达的部位，用体视显微镜拍照。

1.2.5　农杆菌介导的烟草叶片瞬时过表达及ABA胁迫处理

将表达载体pCAMBIA1391-GhPP2C1pro-GUS转入农杆菌GV3101中，瞬时侵染烟草叶片（方法同亚细胞定位），侵染后将烟草叶片平铺在含在200 μmol ABA的MS培养基上，另一组平铺在MS培养基上，22 ℃黑暗培养24 h后进行GUS组织化学染色。在显微镜下观察GUS的染色情况，用体视显微镜拍照。

2　结果与分析

2.1　ABA诱导GhPP2C1的表达情况分析

ABA处理籽球12 h后，GhPP2C1的表达水平相比H₂O处理显著上调（P<0.05）；处理48 h后，GhPP2C1的表达水平与H₂O处理相比差异极显著（P<0.01，图1（a））。同样，在愈伤中也进行GhPP2C1基因的表达量分析（图1（b））。用10 μmol ABA处理0、6、12和24 h后进行荧光定量检测，发现在处理12 h后GhPP2C1基因的表达水平显著上调，与籽球中结果一致。上述结果表明，ABA可显著诱导GhPP2C1的表达上调，GhPP2C1可能参与调控ABA信号转导，进而调控球茎休眠解除。

2.2　ABA诱导GhPP2C1入核

为进一步探究GhPP2C1的功能，观察其亚细胞定位。结果表明，GhPP2C1定位在细胞质中（图2）。此外，本研究在分析GhPP2C1pro时，发现其启动子序列中有ABA响应元件（图3）。因此，为了验证GhPP2C1可能被ABA诱导入核的猜想，在农杆菌侵染烟草后2 d将烟草圆片放置在100 μmol ABA的MS培养基上，用共聚焦显微镜进行观察。结果显示，空载35S：GFP定位在细胞核和细胞质中；GhPP2C1蛋白经过ABA处理后，部分GhPP2C1从细胞质被诱导入核。根据上述结果猜测，当ABA积累时，GhPP2C1被诱导入核，参与调控ABA信号相关基因的转录，影响唐菖蒲球茎休眠解除。

2.3　 GhPP2C1基因启动子响应元件分析

为了更好的探究GhPP2C1与ABA的关系，本研究分析了其启动子中的响应元件。首先，采用HighTail-PCR的方法，以唐菖蒲品种‘Rose Supreme’的DNA为模板，进行PCR扩增，获得1 477 bp启动子序列。利用PlantCARE网站分析其启动子中包含的顺式作用元件。结果显示，GhPP2C1的启动子中包含转录起始、激素和非生物胁迫等顺式作用元件（图3）。其中，G-box是植物中普遍的受信号诱导的顺式作用元件；GATA box可能与组织特异表达相关，暗示着GhPP2C1可能在特异的组织器官中表达。激素响应元件包含ABA响应元件ABREATCONSENSUS（5'-YACGTGGC -3'） 、MYCCONSENSUSAT（5'-CANNTG-3'） 和赤霉素响应元件CAREOSREP1（5'-CAACTC-3'）。非生物胁迫元件包含干旱响应元件MYBCORE（5'-CNGTTR-3'）、MYB1AT（5'-WAACCA-3'）和低温响应元件LTRECOREAT COR15（5'-CCGAC-3'）。以上结果表明，GhPP2C1可能受激素、干旱和低温等非生物胁迫诱导表达，在多个生物过程中发挥着重要作用。

2.4　ABA对GhPP2C1启动子活性的影响

为了深入研究ABA是否影响GhPP2C1启动子活性，本研究构建了GhPP2C1pro-GUS载体，转化至拟南芥Col中进行异源稳定表达及在烟草叶片进行瞬时表达。在烟草中，对照组中GUS表达较弱，ABA处理后烟草叶片中的GUS活性显著提高（图4（a））。说明在烟草叶片中ABA可以激活GhPP2C1启动子活性。GhPP2C1pro-GUS异源表达拟南芥被放置在不同浓度的ABA溶液和H₂O中处理。结果显示，对照组GUS活性微弱，随着ABA浓度的升高，GUS活性增强，且集中在根尖维管束部位（图4（b））。以上结果推测，GhPP2C1启动子活性不仅可以受ABA诱导上调，并且可能在特异的组织器官中表达。

2.5　 35S：GhPP2C1异源过表达拟南芥对ABA的敏感性分析

为了深入研究GhPP2C1的生物学功能，本研究将35S：GhPP2C1（OE#1、OE#2和OE#3）株系和野生型（Col）拟南芥种植在含不同浓度ABA的MS培养基上垂直培养，7 d后观察表型并测量根长（图5）。结果表明，在不同浓度ABA的培养基中，Col和过表达GhPP2C1株系均可生长。在含有50 μmol ABA的培养基上，Col、OE#2和OE#3株系的根均被显著抑制生长，但OE#1株系表现出对ABA的低敏感性。在含有100 μmol ABA的培养基上，OE#1和OE#3株系的根长与野生型相比显著增长。在150 μmol ABA的培养基上，野生型的根长被显著抑制，3个过表达株系对ABA的敏感性显著低于野生型。

接着用0.5、1.0和3.0 μmol ABA处理过表达野生型拟南芥的种子，观察胚根伸出和子叶显现的情况（图6）。未施加ABA时，转基因株系与野生型的胚根伸出和子叶显现情况并无太大差异，仅在层积处理后恢复生长1 d时，OE株系子叶显现率明显高于野生型。施用0.5 μmol ABA后，所有转基因株系胚根的萌发率和子叶显现率均高于野生型，表现出对ABA的弱敏感性。施用1.0 μmol ABA后，所有转基因株系的胚根都正常伸出且发生率高于野生型；生长6 d后，野生型拟南芥的胚根伸出率约为40%，远低于转基因株系（胚根伸出率90%以上）；野生型子叶几乎不能显现，而转基因株系的子叶显现率可达60%以上。施用3.0 μmol ABA后，转基因和野生型拟南芥的胚根和子叶生长情况都受到不同程度的抑制；生长6 d后，野生型拟南芥的萌发完全被抑制，胚根无法伸出以及子叶无法显现；而转基因株系的胚根伸出率可达40%左右，子叶显现率为5%左右。根据上述结果，推测GhPP2C1可能负调控ABA的信号传导，正调控球茎休眠解除。

2.6　 GhPP2C1调控ABA信号通路基因表达分析

在拟南芥中过表达GhPP2C1后，ABA信号通路中下游基因AtABI5、AtABI3、AtEM1、AtRD29A和AtRD29B的表达量显著下降，其中在OE#1和OE#2株系中AtABI3和AtRD29A的表达量下降最显著（图7）。此外，在唐菖蒲的愈伤中过表达GhPP2C1后，检测GhABI5的表达量也显著下降（图8）。综上，推测GhPP2C1可能是通过负调控ABA信号传导，进而增强对ABA的敏感性。

2.7　 35S：GhPP2C1过表达株系株型分析

为了探究GhPP2C1是否具有多种生物学功能，本研究观察35S：GhPP2C1过表达株系的表型并统计数据（图9）。结果表明，与野生型相比，35S：GhPP2C1过表达株系表现出分枝数目显著增加、株高显著增高和种荚的数量增多等表型，推测GhPP2C1基因可能参与调控生长发育等多个过程中。

3　讨论与结论

3.1　 GhPP2C1受ABA诱导且负调控ABA信号通路

高等植物中PP2C家族在调节植物生长发育、响应生物和非生物胁迫等方面具有重要作用。前人研究表明，在唐菖蒲小籽球贮藏期间ABA的含量先升高后降低，施用低浓度的ABA促进GhPP2C1显著上调^［16］。此外，在水稻和鸢尾的研究发现，ABA可以诱导PP2C基因的高表达，PP2C基因的表达水平呈现先升高随后下降的趋势^［23-24］。ABA水稻浸根处理24 h后OsBIPP2C1表达量最大^［23］。施用ABA后山毛榉种子FsPP2C1的表达量显著升高^［25］。PP2C也被报道广泛参与ABA调控的各种信号途径中，包括ABA诱导的种子萌发/休眠和幼苗根系的伸长等^［26］。本研究表明，外施ABA显著诱导唐菖蒲球茎和愈伤中GhPP2C1表达上调，在处理的12 h达到最高峰。并且，在GhPP2C1的异源过表达拟南芥中检测到AtABI5、AtABI3、AtEM1、AtRD29A和AtRD29B的表达量显著下降。结合前人的研究结果推测GhPP2C1可能通过参与ABA信号转导途径来调控球茎休眠解除。

3.2　ABA可诱导GhPP2C1入核且激活其启动子活性

前人研究表明，植物PP2C蛋白羧基端具有行使催化功能的结构域，氨基端延伸区有跨膜区域和激酶互作区域^［27］。AtABI1有核定位信号（Nuclear localization signal， NLS）^［28］。山毛榉FsPP2C2定位于细胞质中，外源施用ABA可以诱导其入核^［29］。推测GhPP2C1与拟南芥AtABI1在羧基端的氨基酸序列具有相似性，可被ABA诱导入核后发挥功能。本研究表明，GhPP2C1定位于细胞质中，外施ABA诱导其入核发挥功能，但ABA是如何诱导其入核有待进一步验证。

有研究发现，在花生中PP2C同源基因Aradu.P2C14、Aradu.YH8NY、Araip.CC2EP和Araip.6KE2F的启动子上有响应赤霉素元件WRKY71OS、响应种子萌发的元件POLASIG1、响应ABA信号转导的元件ABRE3HVA22及响应植物激素合成元件GADOWNAT等^［30］。在谷子的PP2C基因启动子中发现有多个响应ABA、干旱和低温等元件，此外还有MYB、MYC和WRKY类转录因子的结合元件^［31］。在木薯MePP2C24的启动子上也发现ABA响应元件^［32］。本研究表明，GhPP2C1基因启动子序列中有ABA、GATA box及低温等顺式作用元件，结合前人的研究结果，表明非生物胁迫可能调控GhPP2C1启动子的活性。本研究还发现该序列中有CAAT box和TATA box，这些元件可以调控转录起始精确度和效率。

本研究还发现，在拟南芥和烟草中ABA处理促进GhPP2C1启动子活性在根尖和叶片中表达，也验证了本研究中GhPP2C1启动子区域存在ABA顺式作用元件的研究结果。推测GhPP2C1被ABA诱导入核来调控ABA相关基因的表达，进而参与调控球茎休眠解除，还需进一步验证分析。

3.3　过表达GhPP2C1降低对ABA的敏感性且促进拟南芥生长发育

大量研究表明，ABA抑制种子萌发，如外源施用ABA会显著抑制小麦^［33］、拟南芥^［34］、黄瓜^［35］和水稻^［36］等植物种子的萌发。abi1突变体导致拟南芥对ABA敏感性减弱^［37］，abi2突变体的PP2C酶活性与野生型相比显著降低^［38］。此外，过表达MdPP2C-like的转基因苹果愈伤降低了对ABA的敏感性^［39］。35S：FsPP2C1转基因拟南芥种子休眠程度较低，对ABA弱敏感^［25］。本研究也表明，在拟南芥中过表达GhPP2C1后，转基因拟南芥可以显著降低对ABA的敏感性。

此外，PP2C家族成员也在植物的生长发育过程中发挥重要作用。研究发现，在水稻中OsPP2C09可以正向调控植物生长，在ABA处理后OsPP2C09迅速在根系中积累且表达量高于地上部分，促进水稻的生长发育和抵御干旱等非生物胁迫^［40］。Sugimoto等^［41］发现在拟南芥中过表达AtPP2CF1后，转基因拟南芥的花序生长加速，并且生物产量增加。本研究结果表明，在拟南芥中过表达GhPP2C1能促进分枝数目、株高和种荚数量的增长，显著促进拟南芥的生长发育。推测GhPP2C1可促进植株根系和茎的生长进而促进植株吸收水分、养分，对植株生长具有重要作用。

综上所述，本研究表明GhPP2C1在响应ABA信号转导过程中可能参与减弱ABA信号传导，减弱过表达GhPP2C1基因的拟南芥株系对ABA的敏感性，促进转基因拟南芥种子的萌发，且对后续转基因拟南芥的营养生长发挥着重要作用。本研究为深入解析唐菖蒲GhPP2C1基因的功能奠定了理论基础。

参考文献

[1] 吴健.唐菖蒲 GhNCED 和 GhABI5 在调控球茎休眠中的作用机制［D］.北京：中国农业大学，2016

[2] Wu J. Molecular mechanism of GhNCED and GhABI5 in regulating Gladiolus corm dormancy［D］. Beijing： China Agricultural University， 2016 （in Chinese）

[3] Cai F F， Jin X， Tian Y X， Huang Z M， Wang X L， Zhang Y P， Sun Y Q， Shao C S. Molecular regulation of bud dormancy in perennial plants［J］. Plant Growth Regulation， 2023： 1-11

[4] Luo X， Yi J， Zhong X H， Lian Q L， Khan M A， Cao X， Li X X， Gao M W， Wu J， Chen J， Yi M F. Cloning， characterization and expression analysis of key genes involved in ABA metabolism in Gladiolus cormels during storage［J］. Scientia Horticulturae， 2012， 143： 115-121

[5] 李娜， 王飞. 唐菖蒲的繁育技术及病虫害防治［J］. 吉林蔬菜， 2014（3）： 51-52

[6] Li N， Wang F. Breeding techniques and pest control of gladiolus［J］. Jilin Vegetable， 2014（3）： 51-52 （in Chinese）

[7] Horvath D P， Anderson J V， Chao W S， Foley M E. Knowing when to grow： Signals regulating bud dormancy［J］. Trends in Plant Science， 2003， 8（11）： 534-540

[8] Wu J， Seng S S， Sui J J， Vonapartis E， Luo X， Gong B H， Liu C， Wu C Y， Liu C， Zhang F Q， He J N， Yi M F. Gladiolus hybridus ABSCISIC ACID INSENSITIVE 5 （GhABI5） is an important transcription factor in ABA signaling that can enhance Gladiolus corm dormancy and Arabidopsis seed dormancy ［J］. Frontiers in Plant Science， 2015， 6： 960

[9] Wu J， Wu W J， Liang J H， Jin Y J， Gazzarrini S， He J N， Yi M F. GhTCP19 transcription factor regulates corm dormancy release by repressing GhNCED expression in Gladiolus ［J］. Plant and Cell Physiology， 2019， 60（1）： 52-62

[10] Liang J H， Li J R， Liu C， Pan W Q， Wu W J， Shi W J， Wang L J， Yi M F， Wu J. GhbZIP30-GhCCCH17 module accelerates corm dormancy release by reducing endogenous ABA under cold storage in Gladiolus ［J］. Plant Cell and Environment， 2023， 46（7）： 2078-2096

[11] Li J R， Pan W Q， Liang J H， Liu C， Li D Q， Yang Y D， Qu L W， Gazzarrini S， Yi M F， Wu J. BASIC PENTACYSTEINE2 fine-tunes corm dormancy release in Gladiolus ［J］. Plant Physiology， 2023， 191（4）： 2489-2505

[12] Wang Y F， Liao Y Q， Wang Y P， Yang J W， Zhang N， Si H J. Genome-wide identification and expression analysis of StPP2C gene family in response to multiple stresses in potato （ Solanum tuberosum L）［J］. Journal of Integrative Agriculture， 2020， 19（6）： 1609-1624

[13] Hu W， Yan Y， Shi H T， Liu J H， Miao H X， Tie W W， Ding Z H， Ding X P， Wu C L， Liu Y， Wang J S， Xu B Y， Jin Z Q. The core regulatory network of the abscisic acid pathway in banana： Genome-wide identification and expression analyses during development， ripening， and abiotic stress ［J］. BMC Plant Biology， 2017， 17（1）： 145

[14] Shazadee H， Khan N， Wang J J， Wang C C， Zeng J G， Huang Z Y， Wang X Y. Identification and expression profiling of protein phosphatases （PP2C） gene family in Gossypium hirsutum L ［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（6）： 1395

[15] Fan K， Yuan S N， Chen J， Chen Y R， Li Z W， Lin W W， Zhang Y Q， Liu J P， Lin W X. Molecular evolution and lineage-specific expansion of the PP2C family in Zea mays ［J］. Planta， 2019， 250（5）： 1521-1538

[16] Yu X F， Han J P， Wang E F， Xiao J E， Hu R， Yang G X， He G Y. Genome-wide identification and homoeologous expression analysis of PP2C genes in wheat （ Triticum aestivum L）［J］. Frontiers in Genetics， 2019， 10： 561

[17] Singh A， Giri J， Kapoor S， Tyagi A K， Pandey G K. Protein phosphatase complement in rice： Genome-wide identification and transcriptional analysis under abiotic stress conditions and reproductive development ［J］. BMC Genomics， 2010， 11： 435

[18] Wu J， Jin Y J， Liu C， Vonapartis E， Liang J H， Wu W J， Gazzarrini S， He J N， Yi M F. GhNAC83 inhibits corm dormancy release by regulating ABA signaling and cytokinin biosynthesis in Gladiolus hybridus［J］. Journal of Experimental Botany， 2019， 70（4）： 1221-1237

[19] Liao D Q， An R P， Wei J H， Wang D M， Li X N， Qi J J. Transcriptome profiles revealed molecular mechanisms of alternating temperatures in breaking the epicotyl morphophysiological dormancy of Polygonatum sibiricum seeds［J］. BMC Plant Biology， 2021， 21（1）： 370

[20] Ni L， Fu X P， Zhang H， Li X， Cai X， Zhang P P， Liu L， Wang Q W， Sun M M， Wang Q W， Zhang A Y， Zhang Z G， Jiang M Y. Abscisic acid inhibits rice protein phosphatase PP45 via H₂O₂ and relieves repression of the Ca²⁺/CaM-dependent protein kinase DMI3［J］. The Plant Cell， 2019， 31（1）： 128-152

[21] Endo A， Egawa C， Oohashi M， Meguro-Maoka A， Shimosaka E， Sato Y. Ectopic expression of mutated type 2C protein phosphatase OsABI-LIKE2 decreases abscisic acid sensitivity in Arabidopsis and rice［J］. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 12320

[22] Singh A， Jha S K， Bagri J， Pandey G K. ABA inducible rice protein phosphatase 2C confers ABA insensitivity and abiotic stress tolerance in Arabidopsis ［J］. PLoS One， 2015， 10（4）： e0125168

[23] He Z H， Wu J F， Sun X P， Dai M Q. The maize clade A PP2C phosphatases play critical roles in multiple abiotic stress responses［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（14）： 3573

[24] Liu Y G， Chen Y L. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences［J］. BioTechniques， 2007， 43（5）： 649-656

[25] 胡学博.水稻蛋白磷酸酶2C基因 OsBIPP2C1 和 OsBIPP2C2 的克隆鉴定与功能分析［D］.杭州：浙江大学，2004

[26] Hu X B. Molecular cloning and functional analysis of OsBIPP2C1 and OsBIPP2C2 two novel Protein phosphatase 2C genes in Rice［D］. Hangzhou： Zhejiang University， 2004 （in Chinese）

[27] 倪飞.鸢尾蛋白磷酸酶2C（PP2C）基因的克隆和功能分析及拟南芥PP2C基因家族的鉴定和基因组学分析［D］.泰安：山东农业大学，2009

[28] Ni F. Cloning and functional analysis of a Protein phosphatase 2C gene （ IrisPP2C1 ） in the flower of Iris tectorum and genome-wide analysis of PP2C family in Arabidopsis ［D］. Taian： Shandong Agricultural University， 2009 （in Chinese）

[29] González-García M P， Rodríguez D， Nicolás C， Rodríguez P L， Nicolás G， Lorenzo O. Negative regulation of abscisic acid signaling by the Fagus sylvatica FsPP2C1 plays a role in seed dormancy regulation and promotion of seed germination［J］. Plant Physiology， 2003， 133（1）： 135-144

[30] 胡晓丽， 李德全. 植物蛋白磷酸酶2C（PP2C）及其在信号转导中的作用［J］. 植物生理学通讯， 2007， 43（3）： 407-412

[31] Hu X L， Li D Q. Protein phosphatase 2C in plants and its functions of signal transduction［J］. Plant Physiology Communications， 2007， 43（3）： 407-412 （in Chinese）

[32] Stone J M， Collinge M A， Smith R D， Horn M A， Walker J C. Interaction of a protein phosphatase with an Arabidopsis serine-threonine receptor kinase［J］. Science， 1994， 266（5186）： 793-795

[33] Moes D， Himmelbach A， Korte A， Haberer G， Grill E. Nuclear localization of the mutant protein phosphatase abi1 is required for insensitivity towards ABA responses in Arabidopsis ［J］. The Plant Journal， 2008， 54（5）： 806-819

[34] Lorenzo O， Nicolás C， Nicolás G， Rodríguez D. Molecular cloning of a functional protein phosphatase 2C （FsPP2C2） with unusual features and synergistically up-regulated by ABA and calcium in dormant seeds of Fagus sylvatica ［J］. Physiologia Plantarum， 2002， 114（3）： 482-490

[35] 张紫燕， 王艺喆， 苏良辰. 花生中4个蛋白磷酸酶PP2C基因的启动子结构及功能分析［J］. 分子植物育种： 1-12

[36] Zhang Z Y， Wang Y Z， Su L C. Structural and functional analysis of promoters of four Protein phosphatase PP2C genes in Peanut ［J］. Molecular Plant Breeding： 1-12 （in Chinese）

[37] 闵东红， 薛飞洋， 马亚男， 陈明， 徐兆师， 李连城， 刁现民， 贾冠清， 马有志. 谷子PP2C基因家族的特性［J］. 作物学报， 2013， 39（12）： 2135-2144

[38] Min D H， Xue F Y， Ma Y N， Chen M， Xu Z S， Li L C， Diao X M， Jia G Q， Ma Y Z. Characteristics of PP2C gene family in foxtail millet （ Setaria italica ）［J］. Acta Agronomica Sinica， 2013， 39（12）： 2135-2144 （in Chinese）

[39] 吴春来.木薯蛋白磷酸酶基因 MePP2C24/26 在ABA介导的干旱应答中的功能研究［D］.武汉：华中科技大学，2023

[40] Wu C L. The functions of Protein phosphatase genes MePP2C24/26 in ABA-mediated drought response in Cassava （ Manihot esculenta Crantz ） ［D］. Wuhan： Huazhong University of Science and Technology， 2023 （in Chinese）

[41] 孙果忠， 张秀英， 肖世和. 活性氧对ABA和水分胁迫抑制的小麦萌发胚内α-淀粉酶表达的影响［J］. 麦类作物学报， 2005， 25（4）： 50-53

[42] Sun G Z， Zhang X Y， Xiao S H. Effect of reactive oxygen species on α-amylase expression of germinating wheat embryo treated with ABA and water stress［J］. Journal of Triticeae Crops， 2005， 25（4）： 50-53 （in Chinese）

[43] 陈斌卿.拟南芥KTN1负调控ABA信号途径参与调节种子萌发的分子机制研究［D］.北京：中国农业大学，2020

[44] Chen B Q. Arabidopsis KTN1 negatively regulates ABA signaling pathway for seed germination［D］. Beijing： China Agricultural University， 2020 （in Chinese）

[45] 管炜， 曹明明， 李淑菊， 王惠哲， 杨瑞环， 邓强. 外源ABA抑制黄瓜种子采前瓜内萌发的初步研究［J］. 农业科技通讯， 2016（5）： 122-125

[46] Guan W， Cao M M， Li S J， Wang H Z， Yang R H， Deng Q. Preliminary study on exogenous ABA inhibiting pre harvest germination of cucumber seeds［J］. Bulletin of Agricultural Science and Technology， 2016（5）： 122-125 （in Chinese）

[47] 周述波， 贺立红， 贺立静， 林伟. ABA抑制杂交水稻亲本种子萌发的基础生理变化研究［J］. 广东农业科学， 2016， 43（8）： 1-5

[48] Zhou S B， He L H， He L J， Lin W. Study on basic physiological effects of exogenous ABA on germination of hybrid rice parent line seeds［J］. Guangdong Agricultural Sciences， 2016， 43（8）： 1-5 （in Chinese）

[49] Gosti F， Beaudoin N， Serizet C， Webb A A， Vartanian N， Giraudat J. ABI1 protein phosphatase 2C is a negative regulator of abscisic acid signaling［J］. The Plant Cell， 1999， 11（10）： 1897-1909

[50] Merlot S， Gosti F， Guerrier D， Vavasseur A， Giraudat J. The ABI1 and ABI2 protein phosphatases 2C act in a negative feedback regulatory loop of the abscisic acid signalling pathway［J］. The Plant Journal， 2001， 25（3）： 295-303

[51] 张春玲， 周李杰， 王桂栾， 李媛媛， 王小非， 郝玉金. 苹果蛋白磷酸酶基因MdPP2C-Like的克隆及其对ABA的响应分析［J］. 园艺学报， 2018， 45（7）： 1225-1236

[52] Zhang C L， Zhou L J， Wang G L， Li Y Y， Wang X F， Hao Y J. Molecular cloning of Protein phosphatase gene MdPP2C-like in apple and the response analysis of ABA［J］. Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45（7）： 1225-1236 （in Chinese）

[53] Miao J， Li X F， Li X B， Tan W C， You A Q， Wu S J， Tao Y J， Chen C， Wang J， Zhang D P， Gong Z Y， Yi C D， Yang Z F， Gu M H， Liang G H， Zhou Y. OsPP2C09， a negative regulatory factor in abscisic acid signalling， plays an essential role in balancing plant growth and drought tolerance in rice ［J］. New Phytologist， 2020， 227（5）： 1417-1433

[54] Sugimoto H， Kondo S， Tanaka T， Imamura C， Muramoto N， Hattori E， Ogawa K， Mitsukawa N， Ohto C. Overexpression of a novel Arabidopsis PP2C isoform， AtPP2CF1， enhances plant biomass production by increasing inflorescence stem growth ［J］. Journal of Experimental Botany， 2014， 65（18）： 5385-5400

基金资助

国家自然科学基金青年项目(31701952)