牦牛全基因组单纯型微卫星分布特征分析

Analysis on the distribution features of perfect microsatellite in the whole genome of yak

摘要

为探究牦牛全基因组中重复序列的组成特征，本研究以染色体水平的牦牛全基因组（BosGru3.1）为研究对象，利用生物信息学方法对牦牛基因组中的单纯型SSRs序列进行了检测，并对其分布特征进行综合分析。结果表明：1）在牦牛全基因组（2.83 Gb）中，共筛选出778 413个单纯型SSRs，总长度为14.42 Mb，占全基因组序列总长的0.51%，相对频率和相对密度分别为274.92 loci/Mb和5 094.43 bp/Mb。2）牦牛31条染色体中，1号染色体所含的SSRs数量最多（48 592个，6.24%），29号染色体所含的SSRs数量最少（11 758个，1.51%），染色体DNA序列长度与其所含SSRs数量呈显著正相关（P＜0.001）。3）6种重复类型的单纯型SSRs在牦牛基因组中分布不均匀，其中单碱基重复类型的SSRs数量最多（320 592个，41.19%），其次是两碱基（197 824个，25.41%）、三碱基（130 441个，16.76%）、五碱基（75 056个，9.64%）、四碱基（52 523个，6.75%）和六碱基（1 977个，0.25%）。4）各重复类型分别以A、AC、AT、AGC、AAC、AAAT、AAAC、AACTG、AGATC和AACCCT类别的SSRs分布较多，表现出明显的A（T）碱基组成优势。5）各重复类型的SSRs其重复拷贝数分别集中在12~25次（单碱基）、7~26次（两碱基）、5~13次（三碱基）、4~8次（四碱基）、4~7次（五碱基）和4~6次（六碱基）。综上，本研究揭示了牦牛全基因组中单纯型SSRs的分布特征，表明各重复类型的SSRs其频率、密度、优势碱基类别及重复拷贝数均存在差异，呈现出一定的规律性。本研究为深入了解牦牛基因组中重复序列特别是单纯型SSRs的组成和分布特征提供参考，也为后续发掘牦牛特异性SSRs标记、构建遗传图谱及开展标记与性状间的关联分析等研究奠定基础。

Abstract

To explore the distribution and feature of repetitive sequences in yak genome （BosGru3.1）， the perfect SSRs were detected by bioinformatics methods in the yak genome， and its distribution characteristics were comprehensively analyzed.The results showed that： 1） A total of 778 413 perfect SSRs were screened out in yak genome （2.83 Gb）， with a total length of 14.42 Mb， accounting for 0.51% of the total length of the genome sequence. The relative frequency and relative density were 274.92 loci/Mb and 5 094.43 bp/Mb， respectively. 2） Among the 31 chromosomes of yak， chromosome 1 contained the largest number of SSRs （48 592， 6.24%）， and chromosome 29 contained the lowest number of SSRs （11 758， 1.51%）. The length of the chromosomal DNA sequence was significantly positively correlated with the number of SSRs contained. 3） In yak genome， the distribution of six repeat types of perfect SSRs was uneven. Among them， the number of SSRs with mononucleotide repeat type was the highest （320 592， 41.19%）， followed by dinucleotide （197 824， 25.41%）， trinucleotide （130 441， 16.76%）， pentanucleotide （75 056， 9.64%）， tetranucleotide （52 523， 6.75%）， and hexanucleotide （1 977， 0.25%）. 4） Repeat copy category of A， AC， AT， AGC， AAC， AAAT， AAAC， AACTG， AGATC， and AACCCT was predominate in six repeat types， showing a distinct A（T） base composition advantage. 5） The repeat copy numbers of different type of perfect SSRs were concentrated at 12-25 （mononucleotide）， 7-26 （dinucleotide）， 5-13 （trinucleotide）， 4-8 （tetranucleotide）， 4-7 （pentanucleotide）， and 4-6 （hexanucleotide）. In conclusion， there are differences in the frequency， density， dominant base categories， and copy numbers among different types of SSRs， showing certain regularity. The results of this study can provide a reference for a deeper understanding of the composition and distribution features of repetitive sequences， especially perfect SSRs， and lay a foundation for subsequent studies on mining yak-specific SSR markers， constructing genetic maps， and carrying out marker-trait association analyses.

Graphical abstract

关键词

牦牛 / 基因组 / 单纯型微卫星 / 丰度

Key words

yak / genome / perfect microsatellite / abundance

微卫星（Microsatellite），即短串联重复序列（Short tandem repeats，STRs），又称为简单重复序列（Simple sequence repeats，SSRs），是指以1~6个核苷酸为基本单元串联重复而成的DNA序列，广泛分布于真核生物和原核生物的基因组中^［1-2］。微卫星由高突变的核心序列和较为保守的侧翼序列组成。依据核心序列的构成，微卫星被分为3种类型：完全型（Perfect）、不完全型（Imperfect）和复合型（Compound），而完全型微卫星也被称之为单纯型微卫星（Perfect SSRs）^［3］。微卫星在基因组中具有数量多、分布广、杂合率高和共显性遗传等特点，已在种群遗传图谱构建、遗传多样性评估和亲缘关系鉴定等研究领域被广泛应用^［4-6］。

牦牛（Bos grunniens）生活在青藏高原及其毗邻的高山、亚高山地区，为当地牧民提供奶、肉、毛等生活必需品，是青藏高原牧民重要的生产、生活和经济来源，也是当地畜牧业经济可持续发展中不可缺少的重要畜种。在先前的研究中，微卫星标记已被广泛用于牦牛品种（群体）的分子遗传多样性、群体遗传结构和遗传渐渗状况等相关评估和分析中^［7-12］。2012年，牦牛基因组序列首次测定完成，初步绘制了Scaffold水平上的牦牛全基因组序列变异草图^［13］。为探究牦牛全基因组微卫星分布特征及与其他物种间的差异，Ma^［14］分析了6种完全型微卫星在牦牛全基因组中的分布状况，共搜索出723 172个完全型微卫星，平均长度为17.34 bp，相对频率和密度分别为272.18 loci/Mb和4 719.25 bp/Mb；发现单碱基重复类型的微卫星数量最多（44.04%），之后依次为二碱基（24.11%）、三碱基（15.80%）、五碱基（9.50%）、四碱基（6.40%）和六碱基重复类型（0.15%），其中A、AC和AGC等15种重复拷贝类别的微卫星在牦牛基因组中数量较多。随后，戚文华等^［15］通过研究牦牛和水牛全基因组中的完全型微卫星分布特征和差异，发现牦牛和水牛全基因组中的完全型微卫星数量分别为968 134个和1 052 443个，两物种间完全型微卫星分布的相对频率（366.01 loci/Mb 和371.07 loci/Mb）与相对密度（5 686.00 bp/Mb和5 799.34 bp/Mb）均特别接近；二者不同重复类型的微卫星丰度分布模式均为：单碱基>二碱基>三碱基>五碱基>四碱基>六碱基，且相同重复类型的微卫星分布特征也基本一致。

综上，研究者已初步探究了牦牛基因组中单纯型微卫星的分布状况及与其他牛种间的差异^［14-15］。然而，上述已有研究仍存在一定的缺陷与不足，如各研究均基于组装到Scaffold水平的牦牛基因组而开展分析研究^［14-15］，故不能完全揭示牦牛基因组中各染色体所含微卫星的分布状况及其特征差异。然而，随着高通量测序和组装技术的发展，2019年基于二、三代测序及Hi-C技术结合的牦牛高质量基因组（BosGru3.1，GCA_005887515.3）已测序完成且组装到了染色体水平^［16］，这为深入探究牦牛全基因组染色体水平上的微卫星分布特征提供了契机。鉴于此，本研究以染色体水平的牦牛全基因组序列为研究对象，对其单纯型微卫星丰度及分布特征进行系统分析，以期为深入探究牦牛全基因组重复序列的组成、分布特征及发掘特异性分子标记奠定基础。

1　材料与方法

1.1　牦牛全基因组序列来源

本研究分析所用的牦牛全基因组（BosGru3.1）序列从NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载，发布于2019年6月，相关文献于2021年8月报道，登录号为GCA_005887515.3，序列总长度为2 831.46 Mb，Scaffold N50和Contig N50分别为114.39 和44.72 Mb，其全基因组序列均已组装定位到31条染色体上^［16］，序列下载后以FASTA格式保存备用。

1.2　微卫星统计术语定义

微卫星相关术语的定义参照Ma^［14］的研究报道，即：1）重复类型（Repeat type）：指微卫星序列的核心序列由几个碱基（bp）组成。根据核心序列的碱基数目组成，将微卫星分为单碱基（Mononucleotide）、两碱基（Dinucleotide）、三碱基（Trinucleotide）、四碱基（Tetranucleotide）、五碱基（Pentanucleotide）和六碱基（Hexanucleotide）重复类型，本研究主要对上述6种重复类型的单纯型SSRs进行搜索分析；2）重复拷贝类别（Repeat copy category）：指SSRs具体由哪几个碱基组成，如二碱基重复类型中的AG、AC、AT和GC属于4种不同的重复拷贝类别；3）重复拷贝数（Repeat copy number）：指在一个特定的SSRs位点，该序列中核心序列的重复次数。例如（AC）₅，表示在这个SSRs位点，AC这个核心序列的重复次数为5；4）相对频率（Relative frequency，loci/Mb）：指每Mb基因组序列中包含的SSRs数量（loci）；5）相对密度（Relative density，bp/Mb）：指每Mb基因组序列中包含的SSRs序列长度（bp）。

1.3　微卫星搜索方法及统计分析

本研究利用MSDB v2.4（http：//msdb.biosv.com）软件^［17］搜索牦牛全基因组中的单纯型SSRs序列，SSRs搜索标准如下：1~6个碱基重复类型的SSRs其核心序列的最小重复次数分别设置为12、7、5、4、4和4次，微卫星座位两端的侧翼序列长度设置为200 bp。统计分析中，将所有可循环的微卫星序列及其反补序列归为同一类别，如AGG、GGA和GAG以及CCT、TCC和CTC属同一重复拷贝类别。基于SPSS v25软件进行牦牛各条染色体序列长度与其所含单纯型SSRs数量之间的相关分析。

2　结果与分析

2.1　牦牛全基因组中不同重复类型的单纯型微卫星丰度分析

本研究在牦牛全基因组中共搜索到778 413个单纯型SSRs，总长度为14 424 667 bp，占全基因组序列长度的0.51%，相对频率为274.92 loci/Mb，相对密度为5 094.43 bp/Mb（表1）。6种重复类型的单纯型SSRs中，单碱基重复类型的SSRs数目最多，共320 592个，占总数的41.19%，其次是两碱基（25.41%）、三碱基（16.76%）、五碱基（9.64%）、四碱基（6.75%）和六碱基重复类型的单纯型SSRs，六碱基重复类型的SSRs数目最少，仅有1 977个，占总数的0.25%（图1和表1）。

2.2　单纯型微卫星在牦牛染色体上的分布频率和密度

由图2可知，在牦牛的31条染色体中，1号染色体上单纯型SSRs数量最多（48 592个），占总数的6.24%，其次是2号染色体（40 712个，占5.23%）、X染色体（40 699个，占5.23%）、6号染色体（36 633个，占4.71%）和4号染色体（36 235个，占4.65%），而29号染色体上的单纯型SSRs分布数量最少（11 758个，占1.51%）。相关分析表明，牦牛各条染色体序列长度与其所含的SSRs数量间具有高度正相关（r=0.988，P＜0.001；Spearman’s rho，r=0.984，P＜0.001），即染色体DNA序列越长，所含的单纯型SSRs数量越多。各条染色体所含单纯型SSRs的相对频率和相对密度之间也存在差异，其中Y染色体上单纯型SSRs的相对频率和相对密度最高，分别为481.75 loci/Mb和12 370.83 bp/Mb，而12号染色体上单纯型SSRs的相对频率（248.72 loci/Mb）和相对密度（4 558.09 bp/Mb）最低（图3）。相关分析表明，染色体上单纯型SSRs的相对频率（r=-0.271，P=0.141；Spearman’s rho，r=0.066，P=0.724）和相对密度（r=-0.297，P=0.105；Spearman’s rho，r=0.090，P=0.629）与其染色体序列长度相关性不显著。

2.3　牦牛全基因组中不同重复拷贝类别的单纯型SSRs频率和密度大小

由表2可知，在单碱基重复类型中，A（T）碱基重复拷贝类别的SSRs数目最多，共318 425个，占单碱基重复类型SSRs总数的99.32%，总长度为4 679 981 bp，相对频率和相对密度分别为112.46 loci/Mb和1 652.85 bp/Mb。与A（T）碱基重复拷贝类别相比，C（G）碱基重复拷贝类别的SSRs出现频率较低，仅有2 167个，在单碱基重复类型中占比0.68%，总长度、相对频率和相对密度分别为28 156 bp、0.77 loci/Mb和9.94 bp/Mb。两碱基重复类型有AC、AT、AG和GC 4种重复拷贝类别，其中AC重复拷贝类别的SSRs数目最多，共121 982个，占两碱基重复类型SSRs总数的61.66%，相对频率为43.08 loci/Mb；其次是AT（29.12%）和AG（9.06%）重复拷贝类别的SSRs，相对频率分别为20.34 loci/Mb和6.33 loci/Mb（表2）；GC重复拷贝类别的SSRs数量最少，仅324个，占比0.16%，频率为0.11 loci/Mb。牦牛基因组中三碱基重复拷贝类别有AGC、AAC、AAT、ACC、AGG、CCG、AAG、ACT、ATC和ACG 10种，其中AGC类别相对频率最高（33.89 loci/Mb），其次是AAC（3.44 loci/Mb）、AAT（2.61 loci/Mb）和ACC（1.85 loci/Mb）类别，ACG类别相对频率最低（0.02 loci/Mb）。在四碱基重复类型中，共确定了32种重复拷贝类别，其中相对频率较高的是AAAT（4.68 loci/Mb）和AAAC（2.89 loci/Mb）类别，其次是AATG（1.52 loci/Mb）、AAAG（1.49 loci/Mb）和ATCC（1.43 loci/Mb）类别，其余27种重复拷贝类别的SSRs相对频率较低，均小于1.00 loci/Mb（表2）。统计分析发现，牦牛五碱基重复类型中共有88种重复拷贝类别，但仅有2种重复拷贝类别的SSRs相对频率大于1.00 loci/Mb，即AACTG重复拷贝类别的相对频率最高（19.09 loci/Mb），其次是AGATC重复拷贝类别SSRs（4.20 loci/Mb）。本研究共检测到156种六碱基重复拷贝类别的SSRs，但其相对频率均小于1.00 loci/Mb，其中AACCCT重复拷贝类别的SSRs相对频率最高，为0.17 loci/Mb。

2.4　牦牛全基因组中不同重复类型的单纯型SSRs重复拷贝数特征分析

分析发现，牦牛全基因组中各重复类型的单纯型SSRs其核心序列的重复拷贝数主要集中在4~30次，最小拷贝数为4次，最大拷贝数为3 080次。其中单碱基重复类型的单纯型SSRs重复拷贝数介于12~3 080次，但主要集中在12~25次，其SSRs总数为320 081个，占单碱基重复类型SSRs总数的99.84%（图4）；两碱基重复类型的SSRs重复拷贝数分布在7~1 967次，重复拷贝数在7~26次的SSRs共196 761个，占两碱基重复类型SSRs总数的99.46%（图4）；三碱基重复类型的SSRs重复拷贝数介于5~827次，集中在5~13次的SSRs共130 006个，占三碱基重复类型的单纯型SSRs总数的99.67%（图4）；四碱基重复类型的SSRs重复拷贝数介于4~1 153次，其中重复拷贝数在4~8次的SSRs有52 272个，占四碱基重复类型SSRs总数的99.52%；五碱基重复类型的SSRs重复拷贝数分布范围为4~680次，但以4~7次为主（74 210个SSRs），占五碱基重复类型SSRs总数的98.87%（图4）；六碱基重复拷贝类型的SSRs重复拷贝数分布在4~393次，重复拷贝数在4~6次的SSRs有1 673个，占六碱基重复类型SSRs总数的84.62%（图4）。可以看出，每种类型的单纯型微卫星中，微卫星的数量均随着其核心序列拷贝数的增加而有减少的趋势。

3　讨 论

本研究在牦牛的全基因组中共筛选到778 413个单纯型SSRs，其序列总长为14.42 Mb，占全基因组序列总长度的0.51%。与先前研究中普通牛（Bos taurus）（0.48%）、绵羊（Ovis aries）（0.48%）、水牛（Bubalus bubalis）（0.57%）基因组中所含单纯型SSRs比例相比，牦牛基因组中单纯型SSRs所占比例与上述物种均较为接近^{［15，18］}。而与人（Homo sapiens）（3.00%）、小鼠（Mus musculus）（2.85%）相比，单纯型SSRs在牦牛全基因组中的分布比例相对较低^［19-20］。究其原因，可能不但与所使用的检测软件、统计标准不同有关，而且还与各物种本身的特性也有关，即不同物种其基因组大小及其核苷酸组成和排列方式均存在一定的差异，进而导致其基因组所含微卫星重复序列存在较大差异。

在本研究牦牛6种重复类型的单纯型SSRs中，单碱基重复类型的SSRs数量最多，其次是两碱基、三碱基、五碱基、四碱基和六碱基重复类型的SSRs，这与普通牛、水牛、山羊（Capra hircus）、绵羊和藏羚羊（Pantholops hodgsoni）等物种基因组中各重复类型的SSRs分布规律基本一致^{［15，18，21］}。在猪（Sus scrofa）、犬（Canis lupus familiaris）和马（Equus caballus）基因组中，6种重复类型的单纯型SSRs分布规律则是单碱基重复类型的SSRs数量最多，其次是两碱基、四碱基、三碱基、五碱基和六碱基重复类型的SSRs^［22-23］。而在鸡（Gallus gallus）基因组中，除单碱基重复类型的SSRs外，数量最多的则是四碱基重复类型的SSRs^［22］。上述研究结果表明不同物种基因组中单纯型SSRs的分布虽存在差异，但也存在一定的保守性，即物种间亲缘关系越近，SSRs的分布特征也更为相似。此外，本研究分析结果表明，牦牛各条染色体长度与其所含单纯型微卫星的数量呈显著正相关（r=0.988，P＜0.001；Spearman’s rho，r=0.984，P＜0.001），即染色体DNA序列长度越长，其所含的单纯型微卫星数量就越多，这与先前Hancock提出的假说一致^［24］。

在牦牛单碱基重复类型的SSRs中，A碱基重复类别的SSRs所占比例为99.32%，与C碱基重复类别（0.68%）的SSRs相比具有明显优势，这种现象同样被发现于普通牛、绵羊和猪等物种基因组中^{［15，18-23］}。而在两碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复类型的SSRs中，发现以AC、AT、AGC、AAC、AAAT、AAAC、AACTG、AGATC和AACCCT重复拷贝类别的SSRs分布数量较多，表现出明显的A（T）碱基优势，相反富含C（G）碱基的SSRs出现频率较低，这与人、虎皮鹦鹉（Melopsittacus undulatus）、恒河猴（Macaca mulatta）等物种基因组中的SSRs分布规律基本一致^{［19，25-26］}。通常，物种基因组中不同碱基排列编码的蛋白质拥有的功能也不同，位于编码区的SSRs行使着不同的功能，微卫星序列中A（T）、C（G）碱基分布规律的深入研究将有助于了解SSRs的生物学功能^［27-28］。先前的研究表明，三碱基重复类型的SSRs不同于其他重复类型，其与生物体的遗传疾病具有一定的相关性^［29］，外显子中的三碱基重复类型的SSRs也总是最丰富的^［30］。因此，SSRs在牦牛基因组中的功能特征、调控机制以及与某些疾病或性状间的关联分析都有待进一步深入探索。

研究表明，随着SSRs序列长度的增加，其稳定性会逐渐下降，即SSRs重复序列拷贝数越高，越容易发生碱基突变，使原来的单纯型SSRs变为复合型SSRs或非微卫星序列，从而导致SSRs数目减少^［31］。在本研究中，牦牛全基因组中各重复类型的SSRs其核心序列的重复拷贝数存在较大差异，如单碱基、两碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复类型的单纯型SSRs其重复拷贝数分别主要集中在12~25次、7~26次、5~13次、4~8次、4~7次和4~6次。此外，6种重复类型的单纯型SSRs数量均随着其核心序列拷贝数的增加而减少，该现象同样被发现在水牛、普通牛、绵羊、人和小鼠等多个物种的基因组中^{［14-15，18-26］}，提示各物种基因组中的不同类型的SSRs可能经历了不同的动态进化过程或处于基因组内进化的不同阶段。

4　结论

牦牛全基因组中，6种重复类型的单纯型SSRs分布不均匀，单碱基重复类型的SSRs数量最多，其次依次是两碱基、三碱基、五碱基、四碱基和六碱基重复类型的SSRs。31条染色体中，1号染色体上的单纯型SSRs数量最多，29号染色体上单纯型SSRs分布数量最少，各条染色体序列长度与其所含的SSRs数量呈显著正相关。6种重复类型分别以A、AC、AT、AGC、AAC、AAAT、AAAC、AACTG、AGATC和AACCCT重复拷贝类别的SSRs分布相对较多。各重复类型的SSRs其核心重复序列的拷贝数存在较大差异，且6种重复类型的单纯型SSRs数量均随着其核心序列拷贝数的增加而减少。本研究明确了牦牛全基因组中单纯型SSRs的分布特征，为后续深入探究牦牛基因组中重复序列的组成、分布特征、生物学功能及发掘特异性分子标记提供了理论和数据支撑，也为进一步探讨牦牛基因组中重复序列的进化规律和生物学意义奠定基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31960656)

青海省“昆仑英才·高端创新创业人才”计划项目（领军人才）