西藏地区牦牛源沙门菌耐药表型和基因型相关性分析及分子特征分析

Correlation analysis and molecular characteristics analysis of drug resistance phenotype and genotype of Salmonella from yak in Tibet

摘要

为分析当前西藏地区牦牛源沙门菌耐药性与分子特征，本研究对源自西藏地区内的30株沙门菌牦牛粪便分离株，采用药敏纸片法测定相关菌株对β-内酰胺类，喹诺酮类和氨基糖苷类三大类共22种抗生素的耐药情况；采用PCR扩增的方式检测bla-_TEM、bla-_CTX和bla-_CMY等18种耐药基因，并采用卡方检验（Chi-square test）和费希尔精确检验（Fisher）分析耐药表型和耐药基因携带情况的相关性，将相关耐药基因进行扩增测序，并应用序列综合分析软件（CLC Sequence Viewer 7.5和MAGA7.0）分析β-内酰胺类耐药基因（bla-_TEM）和氨基糖苷类耐药基因（armA）编码翻译相关的氨基酸关键位置点位差异与耐药性的关系。结果表明：1）分离的30株沙门菌对于β-内酰胺类存在比较严重耐药现象，30株沙门菌对苯唑西林（OX）耐药占比最多，为60%，对青霉素（PG）、哌拉西林（PRL）、阿莫西林（AMX）、氨苄西林（AM）、羧苄西林（CB）、头孢氨苄（CN）、头孢呋辛（CXM）、头孢曲松（CRO）、头孢拉定（RAD）、头孢他啶（CAZ）、头孢哌酮（CFP）和头孢唑林（CZO）耐药率分别为56.67%、43.33%、40.00%、53.33%、53.33%、46.67%、56.67%、53.33%、50.00%、46.67%、56.67%和30.00%；对喹诺酮药物均为敏感；对氨基糖苷类药物中的链霉素（SM），耐药率为60.00%，卡那霉素（KAN）、妥布霉素（CAS）、阿米卡星（AKM）耐药率分别为13.33%、33.33%和30.00%。2）30株沙门菌的优势耐药谱型为PG/OX/PRL/AMX/AM/CB/SM。3）β-内酰胺类相关的耐药基因bla-_TEM携带率较高（53.30%，16/30），且bla-_TEM与β-内酰胺类药物对青霉素（PG）、苯唑西林（OX）、哌拉西林（PRL）、阿莫西林（AMX）、氨苄西林（AM）、羧苄西林（CB）、头孢氨苄（CN）、头孢呋辛（CXM）、头孢拉定（RAD）、头孢他啶（CAZ）和头孢哌酮（CFP）的耐药性相关性，呈现出显著相关（P＜0.05），氨基糖苷类相关耐药基因armA携带率为60%（18/30），且与妥布霉素（CAS）、链霉素（SM）、阿米卡星（AKM）的耐药性相关性，呈现出显著相关（P＜0.05）。4）部分bla-_TEM和armA编码翻译的氨基酸存在可能与沙门菌耐药能力有关的差异位点。综上，西藏地区沙门菌对β-内酰胺类药物和氨基糖苷类耐药情况形势十分严峻，西藏地区沙门菌对β-内酰胺类药物和氨基糖苷类药物耐药率高的原因是因为其携带耐药基因bla-_TEM和armA，且与氨基酸位点突变有关。本研究为加强对西藏地区牦牛源沙门菌耐药性监测提供理论依据。

Abstract

In order to analyze the drug resistance and molecular characteristics of Salmonella from yaks in Tibet， the drug resistance of 30 strains of Salmonella isolated from yak feces in Tibet were tested by drug-sensitive paper method with determination of resistance of 22 antibiotics including three major categories of lactams， quinolones and aminoglycosides. PCR amplification was used to detect 18 drug resistance genes such as bla-_TEM， bla-_CTX and bla-_CMY.Chi-square test and Fisher Precise test were used to analyze the correlation between the expression forms of drug resistance and the carrying status of drug resistance genes. The related drug resistance genes were amplified and sequenced.CLC Sequence Viewer 7.5 and MAGE 7.0 software was used to analyze the relationship between the difference of key amino acid sites related to coding translation of β-lactam resistance gene （bla-_TEM） and aminoglycoside resistance gene （armA） and drug resistance characteristics. The results showed that： 1） The 30 isolates showed serious resistance to β-lactam， there was a relatively serious phenomenon of resistance to lactams， with 30 strains of Salmonella accounting for the most resistance to oxacillin （OX）， accounted for 60%. They are also resistant to penicillin （PG）， piperacillin （PRL）， amoxicillin （AMX）， amPicillin （AM）， carbenicillin （CB）， cephalexin （CN）， cefuroxime （CXM）， ceftriaxone （CRO）， cefadine （RAD）， ceftazidime （CAZ）， cefoperazone （CFP） and cefzolin （CZO）.The resistance rate were 56.67%， 43.33%， 40.00%， 53.33%， 53.33%， 46.67%， 56.67%， 53.67%， 50.00%， 46.67% 56.67% and 30.00%， respectively. They were sensitive to quinolones. The resistance rate to strePtomycin （SM） in aminoglycoside accounted for 60%， while the resistance rates to kanamycin （KAN）， tobramycin （CAS） and amikacin （AKM） were 13.33%， 33.33% and 30.00%， respectively. 2） The dominant drug resistance profile of 30 Salmonella strains was PG/OX/PRL/AMX/AM/CB/SM. 3） The carrying rate of β-lactam related resistance gene bla-TEM was higher （53.3%， 16/30）. In addition， bla-_TEM and β‍-lactam drugs showed positive effects on penicillin （PG）， oxacillin （OX）， piperacillin （PRL）， amoxicillin （AMX）， ampicillin （AM）， Carbenicillin （CB）， cefalexin （CN）， cefuroxime （CXM）， cefradine （RAD）， ceftazidme （CAZ） and cefoperazone （CFP）. There was a significant correlation （P＜0.05）， the carrying rate of aminoglycosid-related resistance gene armA was 60%（18/30）， and it was significantly correlated with the resistance of tobramycin （CAS）， streptomycin （SM） and Amikacin （AKM） （P＜0.05）. 4） Some amino acids encoded by bla-_TEM and armA had differences sites related to the resistance of Salmonella bacteria. In summary， the situation of β‍-lactam drug and aminoglycoside drug resistance of Salmonella in Tibet is very serious. The reason for the high resistance rate of β‍-lactam drug and aminoglycoside drug in Tibet is that Salmonella bacteria carry resistance genes bla-_TEM and armA， which are related to amino acid site mutations. This study provides a theoretical basis for strengthening the resistance monitoring of yak Salmonella in Tibet.

Graphical abstract

关键词

沙门菌 / β-内酰胺类 / 喹诺酮类 / 氨基糖苷类 / 分子特征

Key words

Salmonella / beta-lactam / quinolones / aminoglycosides / molecular characterization

沙门菌是一种自然界中广泛存在的致病菌，是全球主要危害动物养殖和影响食品公共卫生安全的病原菌之一^［1］。近年来，在青藏高原地区沙门菌感染牦牛形势严峻，牦牛沙门菌血清抗原检测阳性率达到25.88%，而其中山南市和阿里地区阳性率高达51.85%和42.98%^［2］。牛沙门菌病又称牛副伤寒病，主要威胁后备母牛，症状表现为腹泻、流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等严重的繁殖障碍，给青藏地区牦牛养殖业造成严重威胁^［3］。

沙门菌病的治疗过度依赖抗生素，导致其耐药问题日渐严重，青海地区的184份牦牛粪便分离得到的32株沙门菌对β-内酰胺类抗生素耐药率已达100%，对大环内酯类抗生素中的红霉素耐药率达93.75%，卡那霉素的耐药率为18.75%^［4］。柏雪等^［5］研究发现青藏地区牦牛沙门菌总体检出率为7.73%，且牦牛源沙门菌对万古霉素的耐药率高达60%。关奎奎等^［6］对来自川西北高原198份肛拭子样本中分离鉴定得到的24株沙门菌进行耐药分析，发现对庆大霉素的耐药率达到66.7%，且耐药菌株对选用的抗菌药物存在交叉耐药现象。李天娇等^［7］对西藏拉萨、林芝和那曲3个地区分离得到的11株沙门菌进行耐药检测，发现其对６类广谱抗生素药物均表现出不同程度耐药，对β-内酰胺类抗生素的耐药率达81.82%，有菌株对10种抗生素耐药。由此可见，我国牦牛主要养殖地区普遍存在沙门菌耐药现象，沙门菌耐药情况严重，针对牦牛源沙门菌耐药性监测和数据收集具有重要意义。

目前，针对于西藏地区牦牛源沙门菌耐药性研究较为欠缺，主要停留在对牦牛源沙门菌药物敏感性检测及流行病学调查等基础层面研究，而分析沙门菌耐药情况与耐药基因关联性并从分子生物学层面探究沙门菌耐药性产生机制的研究很少。因此，本研究将通过高通量测序对β-内酰胺bla-_TEM基因和氨基糖苷类armA基因分析，将测序后的bla-_TEM和armA基因片段翻译为氨基酸序列并通过与标准沙门菌株比对分析，研究沙门菌的bla-_TEM和armA耐药基因对其相关氨基酸合成的指导作用，进一步阐述沙门菌与耐药基因之间的关联性，以期为后续研究沙门菌耐药相关基因的分子机制方面提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株

本研究在西藏农牧学院高原动物传染病实验室进行。30株牦牛源沙门菌于2019年以来从西藏牦牛腹泻粪便中分离鉴定，由西藏农牧学院预防兽医学实验室提供。菌株编号分别为L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、A1、A2、S1、S2、S3、Z1、Z2、Z3、C1、C2、C3、C4和R1，各菌株的分离来源及血清型信息见表1。质控菌株的选择为E.coli ATCC25922，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2　主要试剂、抗菌药物

TSB培养基、营养琼脂培养基、MH琼脂，购自赛默飞公司；PCR Mix、细菌基因组DNA提取试剂盒、引物，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

青霉素（PG）、苯唑西林（OX）、哌拉西林（PRL）、阿莫西林（AMX）、氨苄西林（AM）、羧苄西林（CB）、头孢氨苄（CN）、头孢呋辛（CXM）、头孢曲松（CRO）、头孢拉定（RAD）、头孢他啶（CAZ）、头孢哌酮（CFP）、头孢唑林（CZO）、诺氟沙星（NFX）、萘啶酸（NA）、环丙沙星（CIP）、庆大霉素（GM）、大观霉素（SC）、卡那霉素（KAN）、妥布霉素（CAS）、链霉素（SM）和阿米卡星（AKM）等22种抗生素药敏片，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2　方法

1.2.1　菌株复壮

将西藏农牧学院预防兽医学实验室保存的30株牦牛源沙门菌接种于装有30 mL TSB培养基的锥形瓶，在37 ℃、120 r/min条件下振荡培养24 h。

1.2.2　药敏试验

将TSB液体培养基培养的沙门菌的菌液浓度调整到1×10⁷ CFU/mL，吸取200 μL菌液到TSA培养基上，使用涂布器涂抹均匀。之后将抗生素药敏纸片分别按区域粘贴到培养基中，放在37 ℃的恒温箱培养24 h。参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准^［8］，以R为耐药、I为中介、S为敏感对抑菌圈大小作出判定^［9-10］。

1.2.3　耐药基因检测

参考相关文献^［11-12］和从NCBI中检索已有的β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类耐药基因序列信息，用DNA Star软件找出其相关的保守序列，然后采用Primer 5软件设计引物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，相关引物序列信息见表2。以30株沙门菌的基因组DNA为模板，分别扩增6种β-内酰胺类抗生素耐药基因（TEM、CTX、CMY、OXA、KPC和LAP），6种喹诺酮类抗生素耐药基因（oqxA、oqxB、qeqA、qnrA、ParE和ParC），以及6种氨基糖苷类耐药基因（armA、rmtB、aadA、aadB、aac（6）-Ⅰb和aac（3）-Ⅱc）。PCR产物经核酸凝胶电泳分析检测。

1.2.4　耐药谱型与基因型分析

根据1.2.2药敏试验的结果，分析30株沙门菌的耐药谱型。采用卡方检验（Chi-square test）和费希尔精确检验（Fisher）精确检验分析每株细菌其耐药基因携带情况与耐药表型关联性。统计学用95%置信区间（95% CI）和比值比（OR）表示，当P＜0.05时，差异显著，当P＞0.05时差异不显著。

1.2.5　耐药基因序列分析比对及遗传进化分析

对30株沙门菌确定的耐药基因，使用NCBI网站设计相关耐药基因的全长cDNA引物序列：bla-_TEM上游引物5'-ATGCGCGACCTTGCGAGAGAAATTACACCGGTCAACA-3'/下游引物5'- CGTACTTTACGCCATGAACGTACTAGGCAATAG-3'，armA上游引物5'-ATGACCCCCAGAATGATAAGACGAAATTACA-3'/下游引物5'- CGTACTGCCCGACTATGACGTACTAGGCAATAG-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；PCR扩增耐药基因bla-_TEM、armA的全长cDNA，由安升达（南京）生命科学技术有限公司测序。利用Editseq、Clustalx1.83和MEGA7对获得的bla-_TEM和armA基因序列进行比对分析。

2　结果与分析

2.1　药敏试验分析

检测30株沙门菌对22种抗生素的耐药性（表3）。30株沙门菌存在比较严重耐药现象，30株沙门菌对OX和SM的耐药率最高，为60.00%（18/30），对CFP、NFX、NA、CIP、GM和SC敏感。对PG、PRL、AMX、AM、CB、CN、CXM、CRO、RAD、CAZ、CFP、CZO、KAN、CAS和AKM耐药率分别为56.67%（17/30）、43.33%（13/30）、40.00%（12/30）、53.33%（16/30）、53.33%（16/30）、46.67%（14/30）、56.67%（17/30）、53.33%（16/30）、50%（15/30）、46.67%（14/30）、56.67%（17/30）、30%（9/30）、13.33%（4/30）、33.33%（10/30）和30.00%（9/30），而对喹诺酮药物均敏感。

2.2　耐药谱型分析

30株沙门菌对22种常见抗菌药物的耐药谱型分析结果见表4。从表中可以看出，30株沙门菌共存在19种不同的耐药谱型，且耐药谱型分布较为分散，其中以PG/OX/PRL/AMX/AM/CB/SM为优势耐药谱型。

2.3　耐药基因检测

沙门菌耐药基因检测采用PCR技术对30株沙门菌进行了TEM、CTX、CMY、OXA、KPC和LAP 6种β-内酰胺类抗生素耐药基因和oqxA、oqxB、qeqA、qnrA、ParE、ParC 6种喹诺酮类抗生素耐药基因以及armA、rmtB、aadA、aadB、aac（6）-Ⅰb、aac（3）-Ⅱc 6种氨基糖苷类抗生素耐药基因检测。其中，16株（53.30%）菌株β-内酰胺类耐药基因bla-_TEM阳性，18株（60.00%）菌株氨基糖苷类耐药基因armA阳性，β-内酰胺耐药菌株bla-_TEM的阳性率为88.89%（16/18），氨基糖苷耐药菌株armA的阳性率为90.00%（18/20），未检测出喹诺酮药物耐药基因（图1）。

2.4　耐药表型及基因相关性分析

β-内酰胺和氨基糖苷类药物耐药表型与耐药基因相关性分析结果显示（表5），沙门菌对PG、OX、PRL、AMX、AM、CB、CN、CXM、RAD、CAZ、CFP、KAN、CAS、SM和AKM 15种药物的耐药表型与耐药基因呈显著相关（OR＞1，P＜0.05，表3），CRO、CZO与耐药基因不相关（OR=0.50，95%CI=0.30~3.80，P=0.588）和（OR=3.00，95%CI=0.58~15.61，P=0.177）。

2.5　沙门菌耐药基因bla-_TEM和armA的氨基酸比对

对其中10株沙门菌分离株和1株标准无耐药性菌株（K1）进行bla-_TEM和armA基因测序，利用CLC S V和MEGA 7.0软件对bla-_TEM和armA编码的氨基酸序列进行比对，各菌株中bla-_TEM基因编码的氨基酸相似性普遍较高，沙门菌菌株N3存在5个氨基酸差异位点（36A→K，84T→V，110Q→L，151D→Y，291R→K），与K1相似性为98.3%；Z1存在3个氨基酸差异位点（36A→K，84T→V，151D→Y），与K1相似性为99.0%；R1有2个氨基酸差异位点（84T→V，168A→T），与K1相似性为99.30%（图1）。armA基因编码的氨基酸相似性也呈现出较高的结果，其中沙门菌L1存在3个氨基酸差异位点（39E→I，47K→E，170K→N），与K1相似性为99.3%；S1存在4个氨基酸差异位点（39E→Y，47K→E，122L→Q，170K→F），与K1相似性为98.4%，L2有2个氨基酸差异位点（122L→Q，170K→N），与K1相似性为99.2%（图2）。

3　讨论

沙门菌是危害西藏牦牛养殖重要的病原微生物之一，严重影响产业发展。养殖场针对该菌的感染主要治疗手段是抗生素治疗，这会使沙门菌耐药情况加剧从而出现多重耐药菌。与此同时，抗生素的过量使用，导致肉制品的药物残留问题也相继出现。所以，针对沙门菌的耐药性与分子特征研究，对科学预防该病具有重要意义。30株沙门菌药物敏感性实验结果显示，分离的30株沙门菌存在较为严重的耐药现象，其中对苯唑西林和链霉素的耐药率最高，为60%，支威等^［13］从江苏省徐州市500份猪肉样品分离得到的60株沙门菌对链霉素的耐药率为71.7%，比本研究结果略高。岳秀英等^［14］研究表明从2660份四川猪养殖场的肛拭子样本中分离获得的151株沙门菌对氨苄西林的耐药率2009—2014年均高于80.00%，与本研究53.30%相比偏高，可能与地域、动物来源和采用的药敏试验方法不同有关。本研究对30株沙门菌的耐药谱型分析结果表明，耐药菌株对选用的抗菌药物存在交叉耐药现象，其中以PG/OX/PRL/AMX/AM/CB为优势耐药谱型。

国内外相关研究表明，中国上海、江苏和美国佐治亚州从猪场分离到的沙门菌均存在类似耐药性^［15-17］。耐药基因检测发现，β-内酰胺类和氨基糖苷类基因携带情况较为严重，喹诺酮类基因未检测到。由此可见，近年来沙门菌的耐药问题已非常严重，且多重耐药现象较为普遍，提示在兽医临床防治沙门菌感染时有必要进行药物敏感性试验以筛选出敏感的抗菌药物进行防治。

沙门菌耐药性的产生既与抗生素频繁的使用有关，也与沙门菌菌株的耐药基因携带情况相关。在抗生素压力的施加下，细菌耐药功能单位会发生改变，造成其耐药性的形成。耐药基因鉴定结果表明，本研究沙门菌菌株bla-_TEM携带率为53.3%，β-内酰胺类耐药沙门菌菌株bla-_TEM基因的携带率为88.89%。革兰氏阴性菌的PLASMID、TRANSPOSON和INTEGRON等基因单位可以促进细菌耐药性的转移和扩散^［18］。随着抗生素在各动物养殖场剂量很大的使用，bla-_TEM耐药基因在很多菌株中都出现了携带情况。2017—2019年中国南方五省副猪格拉菌bla-_TEM基因检测结果显示其阳性率为84.6%^［19］；2005—2017年，我国西北地区养猪场阳性大肠杆菌bla-_TEM携带率为68.2%^［20］，在国外bla-_TEM基因同样存在较高携带率的情况，2009年8月—2010年7月，印度分离得到的219株肺炎克雷伯菌其bla-_TEM基因阳性率高达77.58%^［21］，意大利学者Bertelloni等^［22］在意大利15个养猪场发现36.36%的养殖场存在沙门菌属并携带bla-_TEM基因。本研究中氨基糖苷类药物中庆大霉素都为敏感，这与林亚军等^［23］研究中新疆宠物源沙门菌对该药物敏感性为100%的结果相似。沙门菌对β-内酰胺类药物耐药的主要机制是由于基因突变产生β-内酰胺酶，使药物在与细菌作用前被β-内酰胺酶水解，失去了干扰细菌细胞壁合成的功能^［24］。杨跃飞^［25］研究通过相关检测发现扬州动物医院采集的病料当中分离的352株大肠杆菌对氨基糖苷类药物链霉素的耐药率为58.6%，与本研究中60%的结果相似，但其armA基因的阳性率偏低，只有1.1%。吴桂刚等^［26］研究发现大连市氨基糖苷类高水平耐药基因armA广泛分布在MDR铜绿假单胞菌中，该基因定位在转座子Tn1548的质粒上，提示16SrRNA甲基化酶基因armA的广泛播散可能是可移动元件ISCR1-armA-IS26结构参与其中。

在2种耐药基因cDNA全长扩增测序翻译的氨基酸序列比对中，N3菌株在bla-_TEM基因存在5个位点突变，S1菌株在armA基因存在4个位点突变，对比药敏试验结果和耐药基因检测结果，N3菌株对β-内酰胺类药物普遍耐药，耐药谱为PG/OX/PRL/AMX/AM/CB/RAD/CZO，耐药基因检测其携带TEM、CTX、CMY和LAP。S1菌株耐药谱为PG/OX/PRL/AMX/AM/CB/SM，耐药基因携带armA、armB和rmtB氨基糖苷类耐药基因。推测牦牛源沙门菌耐药性的产生与菌体相关耐药基因指导合成的氨基酸发生位点突变有关，吴瑗等^［27］关于副猪嗜血杆菌对氨基糖苷类药物耐药产生机制研究也证实了这一点。

本研究中，沙门菌菌株β-内酰胺类bla-_TEM和氨基糖苷类armA基因的携带率高于已报道细菌的耐药基因的携带率。由此可见，bla-_TEM和armA基因普遍存在多种细菌并呈现升高的态势，应科学规范使用抗生素，从而控制耐药性进一步恶化。

4　结论

本研究中源自西藏地区有腹泻症状牦牛的沙门菌分离株，其对β-内酰胺类和氨基糖苷类药物耐药率高，β-内酰胺类和氨基糖苷类药物耐药表型和耐药基因检测结果有强关联性，沙门菌对β-内酰胺类和氨基糖苷类药物的耐药性可能与其相应耐药基因bla-_TEM和armA编码的蛋白质发生改变有关，具体耐药机制还需深入研究。因此，应加强西藏牦牛源沙门菌耐药性及耐药基因的监测，改善抗生素不合理使用的现状。

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基金资助

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系项目(CARS-37)

西藏自治区科技厅2019年度重点项目(XZ201902NB04)

2022年西藏自治区级大学生创新创业训练计划项目