小麦3种锈菌PCWDEs家族基因鉴定及表达分析

Identification and expression analysis of PCWDEs family genes in three wheat rust fungi

摘要

为挖掘小麦锈菌侵染过程中发挥关键作用的植物细胞壁降解酶（Plant cell wall-degrading enzymes， PCWDEs）基因，通过生物信息学方法对小麦3种锈菌（叶锈菌、条锈菌和秆锈菌）基因组中的碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes， CAZymes）进行预测分析，在此基础上对其中的PCWDEs基因家族进行全基因组范围的筛选鉴定，并利用qRT-PCR方法对叶锈菌PCWDEs家族成员在侵染过程中的转录水平进行了检测分析。结果表明：1）小麦叶锈菌、条锈菌和秆锈菌基因组分别编码355、322和345个CAZymes家族成员基因以及160、153和158个PCWDEs基因；小麦3种锈菌共含75个保守CAZymes基因亚家族和94个PCWDEs直系同源基因簇。2）16个叶锈菌特异性PCWDEs基因在亲和（Pt15-‘中国春’）/非亲和（Pt15-‘云麦34’）互作过程中均受到不同程度的诱导表达，但非亲和互作中在侵染更早期就已受到诱导上调表达。3）叶锈菌特异性PCWDEs基因簇中有4个PCWDEs被鉴定为类扩展蛋白，其在侵染过程中受到诱导表达，说明类扩展蛋白可能在降解纤维素突破侵染屏障中发挥重要作用。综上，在小麦3种锈菌全基因组范围鉴定了PCWDEs基因，初步明确部分基因在锈菌侵染过程中的表达模式，PCWDEs可能在小麦锈菌致病过程中发挥重要作用。

Abstract

In order to explore the key plant cell wall-degrading enzymes （PCWDEs） genes， which play critical roles in the infection of wheat rust， bioinformatics methods were used to identify and analyze the Carbohydrate-active enzymes （CAZymes） existed in the genomes of three wheat rust fungi including Puccinia triticina （Pt）， Puccinia striiformis f. sp. tritici （Pst） and Puccinia graminis f. sp. tritici （Pgt）. The PCWDEs gene family was screened and identified from these CAZymes genes. The expression patterns for selected PCWDEs members of Pt were analyzed by qRT-PCR. The results showed as follows： 1） The genomes of wheat rust fungi encode 355， 322 and 345 CAZymes family members， and contain 160， 153 and 158 PCWDEs family members， for Pt， Pst， and Pgt， respectively. There are 75 conserved CAZymes gene subfamiles and 94 orthologous gene clusters of PCWDEs in three wheat rust fungi. 2） 16 PCWDEs of Pt unique genes were induced at differential levels in compatible （Pt15-‘Chinese Spring’） and incompatible （Pt15-‘Yunmai 34’） combinations， and some of them were up-regulated earlier in the incompatible combinations. 3） Four Pt unique PCWDEs belonging to one gene cluster of Pt were homologous to extension-like proteins， which were also regulated for transcriptional level during the infection. In summary， all PCWDEs of wheat rust fungi in genome wide were identified， and the transcriptional patterns of some candidates were detected. The results in this study indicated that PCWDEs might play an important role during the infection of rust fungi.

Graphical abstract

关键词

小麦锈菌 / PCWDEs / 生物信息学分析 / qRT-PCR / 侵染机制

Key words

wheat rust fungi / PCWDEs / bioinformatics / qRT-PCR / pathogenic mechanism

小麦锈菌包含叶锈菌（Puccinia triticina， Pt）、条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici， Pst）和秆锈菌（Puccinia graminis f. sp. tritici， Pgt），作为活体营养专性寄生真菌，引发的小麦锈病对小麦产量造成较大损失^［1］。锈菌与寄主表面接触后，通过气孔侵入寄主，形成气孔下囊，然后产生入侵菌丝并形成吸器，通过吸器为自身提供营养，完成定殖^［2］。目前种植抗病品种是防控锈病最经济有效的方式之一^［3］，但在寄主-病原菌共同进化的过程中，锈菌频繁的毒力变异容易导致小麦品种抗性丧失^［4］。因此，挖掘锈菌毒性相关基因，阐明锈菌侵染小麦的分子机制有助于创制新的抗病种质资源。

从病原菌致病因子（毒性）入手，鉴定病菌致病靶点及其调控的寄主互作（防御/免疫）靶点，并通过寄主诱导的基因沉默（Host-induced gene silencing，HIGS）或寄主抗/感病基因的基因编辑可以创制抗病新种质。例如，Qi等^［5］在筛选明确小麦条锈菌重要致病因子基础上，通过HIGS和RNAi技术靶向沉默小麦条锈菌PsCPK1基因，创制了持久抗条锈病的转基因小麦。Wang等^［6］在解析小麦条锈菌致病因子PsSPG1的基础上，明确了其调控小麦免疫因子TaPSIPK1导致感病，通过基因编辑的方法获得了TaPSIPK1功能缺失株系，实现了对小麦锈病的广谱抗性。

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、果胶和木质素组成，是抵御机械损伤和病原菌入侵的第一道物理屏障^［7］。病原菌在侵染过程中通过分泌PCWDEs降解植物细胞壁，这一过程中产生的碳水化合物能被病原菌利用，同时也会影响植物的免疫反应^［8］。不同营养型真菌基因组含有的细胞壁降解酶（CWDEs）数量不同，死体营养型病原菌的CWDEs数量多于半活体和活体营养型真菌^［9］。

所有植物病原真菌分泌的PCWDEs均属于CAZymes^［10］。这些CAZymes分为糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases， GHs）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases， CEs）、氧化还原酶（Auxiliary Activities， AAs）、糖基转移酶（Glycosyl Transferases， GTs）、多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases， PLs）和碳水化合物结合模块（Carbohydrate-Binding Modules， CBMs）^［11］。目前，已有多个CAZymes亚家族被证明参与植物-病原菌互作途径，是病原菌侵染植物细胞的重要毒力因子^［12-13］。Yang等^［14］发现来自稻瘟菌的糖苷水解酶GH12家族基因MoCel12A/B作为损伤相关模式分子（DAMPs）参与植物-病原菌互作；Federico等^［15］将AA17家族鉴定为铜结合裂解多糖单加氧酶（LPMO），LPMO可以降解果糖并负调植物免疫反应；Bilal等^［16］报道了玉米黑粉菌中具有CBM和GH51双结构域的β-1，3-葡聚糖酶UmErc1，该酶可以结合植物细胞壁并抑制植物免疫应答。

CAZymes在病原真菌侵染和定殖寄主过程中发挥着先导、信号等多种不可替代的作用，解析其作用机制对阐明病原菌的致病机制有十分重要的意义。小麦锈病是分布最广、危害最重的小麦病害之一，目前对于小麦锈菌CAZymes的深入研究仍十分薄弱，尤其是PCWDEs在锈菌侵染过程中的生物学功能尚不清楚。虽然，CAZymes已在多种病原菌中^［14-16］被鉴定，但关于小麦锈菌PCWDEs家族成员的系统分析鲜少报道。本研究通过对小麦锈菌全基因组资源进行生物信息学分析，系统挖掘了PCWDEs家族成员，并通过qRT-PCR探究了小麦叶锈菌Pt15特异的PCWDEs的表达模式，旨在挖掘小麦锈菌侵染过程中发挥关键作用的基因，以期为创制小麦抗锈新种质提供参考。

1　材料与方法

1.1　试验材料

供试小麦叶锈菌菌系为Pt15；供试小麦品种为‘中国春’（‘Chinese Spring’， CS-Pt15亲和互作）和‘云麦34’（‘Yunmai 34’， YM34-Pt15非亲和互作）。

1.2　序列来源

Pst基因组信息下载自NCBI，小麦条锈菌生理小种CYR34（登录号GCA_025169535.1）^［17］；Pgt基因组信息下载自JGI，小麦秆锈菌菌系Pgt21-0（登录号Pgt_201_A1）^［18］；Pt基因组信息下载自NCBI，小麦叶锈菌菌系Pt15（登录号GCA_026914185.1）^［19］。

1.3　CAZymes家族注释

通过在线注释平台dbCAN使用默认参数对小麦3种锈菌蛋白序列进行CAZymes家族注释^［20］。利用TBtools制作小麦锈菌CAZymes和PCWDEs家族Venn图^［21］。

1.4　直系同源基因簇分析

选择TBtools对筛选到的小麦3种锈菌CAZymes家族与蛋白序列进行blast比对，获得小麦3种锈菌CAZymes蛋白序列。通过orthovenn2在线分析^［22］，e设置为10^-5。

1.5　系统发育树的构建及蛋白结构预测

利用MEGA11^［23］的ClustalW程序进行序列比对，并利用默认参数寻找匹配到的最佳模型。其中BIC分数最低的是MAC+A+C模型。采用最大似然法构建进化树。使用SiganlP 5.0^［24］预测CAZymes家族蛋白质潜在信号肽，利用SecretomeP 2.0^［25］预测非经典分泌蛋白，通过TMHMM-2.0^［26］在线预测是否存在跨膜螺旋。使用MEME^［27］预测motif组成，NCBI CDD^［28］用于预测保守结构域，利用TBtools制作组合图。

采用Expasy^［29］分析蛋白质的一级结构，通过Phyre2^［30］构建蛋白的3D结构模型。使用IBS绘制蛋白结构域^［31］。使用CBM63和DPBB双结构域预测扩展蛋白^［32］。使用已报道的经典微生物和植物的扩展蛋白^［33］构建系统进化树。

1.6　qRT-PCR检测

取叶锈菌Pt15侵染0、6、12、24、48和72 h的小麦叶片。使用Trizol法提取样品RNA，反转为cDNA。根据候选基因的全长序列，利用Oligo 7软件进行特异性引物设计，以ACTIN为内参（表1），利用qRT-PCR检测候选基因的相对表达量，每处理3次重复。使用2^-ΔΔCT方法分析qRT-PCR的结果。

2　结果与分析

2.1　小麦锈菌CAZymes家族

由图1可知，小麦叶锈菌（Pt）基因组有355个基因被注释为CAZymes家族，包括GH基因152个，GT基因94个，CE基因49个，AA基因40个，7个PL基因和13个CBM基因；小麦条锈菌（Pst）基因组被注释为CAZymes家族成员的有322个，包括GH基因164个，GT基因71个，CE基因43个，AA基因40个，3个PL基因和1个CBM家族基因；小麦秆锈菌（Pgt）基因组含有345个CAZymes家族基因，包括GH家族基因172个，GT家族基因87个，CE家族基因37个，AA家族基因42个，5个PL家族基因和2个CBM家族基因。

3种锈菌共同含有75个CAZymes亚家族，Pt的基因组包含19个特异性CAZymes亚家族（图2）。在Pt基因组中，只有少部分基因被注释到了除CBM63以外的特异性CAZymes亚家族中，有7个基因被注释为CBM63家族成员（图3）。

2.2　小麦锈菌细胞壁降解酶家族

对小麦锈菌CAZymes家族进行注释（表2），Pt基因组的160个CAZymes注释为PCWDEs；Pst基因组注释到153个PCWDEs基因；Pgt有158个PCWDEs。3种锈菌的PCWDEs包含有94个保守性直系同源基因簇，Pst和Pt的PCWDEs各包含5个特异性同源基因簇，Pgt基因组中含有3个特异性同源基因簇（图4）。

由图5可知，在3种锈菌的94个直系同源基因簇中，大多数基因簇被注释为参与代谢过程（GO： 0008152），碳水化合物代谢过程（GO： 0005975），大分子代谢过程（GO： 0043170），多糖代谢过程（GO： 0005976），细胞代谢过程（GO： 0044237），生物过程（GO： 0008150），细胞过程（GO： 0009987）；还有部分参与氮化合物代谢过程（GO： 0006807），生物体对刺激的反应（GO： 0050896），脂质代谢过程（GO： 0006629）和能量储备代谢过程（GO： 0006112）。分子功能多被注释为参与氧化还原反应（GO： 0016491）。综上，小麦锈菌直系同源基因簇只与生物过程和分子功能相关，主要参与代谢过程和氧化还原途径。

2.3　小麦叶锈菌Pt15特异性PCWDEs的理化性质及motif分析

小麦叶锈菌Pt15的特异性细胞壁降解酶分为2个部分：未被注释到任何直系同源基因簇的小麦叶锈菌PCWDEs基因和仅含有小麦叶锈菌PCWDEs基因的同源基因簇（图4）。根据CAZymes家族对19个未被注释到任何直系同源基因簇的Pt特异性PCWDEs命名（表3）。对其一级结构进行分析发现，大部分PCWDEs为亲水性蛋白，只有PtCE1和PtCE2预测为疏水性蛋白。8个PCWDEs蛋白不稳定（不稳定系数>40），11个较稳定。利用SignalP 6.0预测信号肽和TMHMM 2.0预测跨膜结构域以筛选经典分泌蛋白，保留含有信号肽且不含跨膜结构域的蛋白。结果显示，只有PtAA4和PtPL1被预测为经典分泌蛋白。随后对非经典分泌蛋白进行了预测，去除掉SecretomeP 2.0中“NN-score”<0.5的结果，除PtAA5、PtAA6和PtGH4外其他均被预测为非经典分泌蛋白。motif和结构域预测显示Pt特异性PCWDEs没有形成明显的聚类，且数量和类型不同，说明此类基因是多样化的（图6）。

2.4　小麦叶锈菌特异性PCWDEs表达模式分析

由图7可知，所有的未被分配到直系同源基因簇的Pt特异性PCWDEs在小麦-叶锈菌亲和/非亲和互作过程中均受到诱导表达。PtCE4、PtGH2、PtGH1、PtCE5、PtCE1、PtCE3和PtAA2的表达水平在亲和互作12 h上调，非亲和互作6 h上调，其中PtGH1、PtCE5、PtCE1、PtCE3和PtAA2在72 h再次上调表达。PtAA1在亲和互作中6 h开始持续上调表达，在非亲和互作则表现为48 h到达峰值后下调表达。PtAA3在亲和表达中72 h上调，但在非亲和互作中则提前到48 h上调。PtAA4在亲和互作过程中持续下调表达，在非亲和互作72 h达到峰值。PtPL1在亲和互作中12 h上调，非亲和互作中则持续下调，PtPL2恰好相反。PtGH3在亲和互作48 h上调，在非亲和互作12 h上调。PtCE2和PtCE7在亲和/非亲和互作过程中具有相似的表达趋势。

2.5　小麦叶锈菌CBM63家族

利用CAZy数据库查询CBM63家族注释，Pt的7个CBM63家族基因有4个符合扩展蛋白的C端DPBB和N端CBM63双结构域（图8（a））。叶锈菌与木霉、链霉等6种微生物及水稻、拟南芥等3种植物扩展蛋白的进化关系表明，叶锈菌CBM63家族基因和镰刀菌的扩展蛋白FSUBG_753存在较高同源性，说明扩展蛋白序列具有保守性（图8（b））。对这些类扩展蛋白成员的结构预测发现，与已知的蓝状菌扩展蛋白TlEXLX1具有相似的三级结构（图8（c））。

2.6　小麦叶锈菌CBM63家族表达模式分析

由图9可知，PtCBM1在亲和互作过程中6 h表达受到抑制，12 h表达上调，24 h达到峰值后表达下调；非亲和互作过程中表现为6 h上调，12 h下调后在24 h出现上调，48 h又下调的表达趋势，在72 h再次上调达到峰值。PtCBM2在亲和及非亲和互作中均表现出24 h前表达下调和48 h后表达上调（图10）。PtCBM3的表达在亲和互作及非亲和互作的前72 h均受到抑制（图11）。PtCBM4在亲和及非亲和互作6和12 h均显著被抑制，24 h表达又上调（图12）。

3　讨　论

碳水化合物活性酶（CAZymes）是参与碳水化合物组装、修饰或解构的酶^［34］。CAZymes的组成对于真菌的竞争力、生长和繁殖都非常重要^［35］。大多数植物病原真菌通过分泌PCWDEs打破和穿透细胞壁^［36］，其中包括果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶和木葡聚糖酶等^［37-38］。本研究对小麦3种锈菌CAZymes和PCWDEs进行了预测及表达模式分析，小麦叶锈菌、条锈菌和秆锈菌分别编码355、322和345个CAZymes家族成员基因及160、153和158个PCWDEs成员基因。小麦3种锈菌共含75个保守CAZymes基因家族和94个PCWDEs家族直系同源基因簇。利用生物信息学对3种大豆锈菌基因组进行注释，其中约含有2%的CAZymes^［39］，在小麦锈菌也存在类似结果，但氧化还原酶的数量存在较大差别，这可能与它们的寄主差异有关^［40］。

李闯等^［41］研究表明，小麦3种锈菌的CAZymes中拥有庞大的分泌蛋白数量，CAZymes分泌蛋白可能在锈菌致病过程中作为潜在毒力因子发挥重要作用。小麦锈菌的PCWDEs也被证明在小麦-病原菌互作过程中起到一定作用^［42］，可能参与植物基础免疫（PTI， Pattern-triggered immunity） 的互作调控过程。在小麦感染Pgt和Pst过程中，几丁质酶（GH18家族）、转化酶、内切-1，4-β-葡聚糖酶（来自GH5）和内切-β-甘露聚糖酶（来自GH5）转录水平显著上调^［43-44］。在Pt侵染过程中，外切和内切葡聚糖酶，酯酶和果胶酶活性显著增加，表明这些酶在Pt感染期间协同降解植物细胞壁^［45］。本研究中，Pst和Pgt中GH5数量最多，而在Pt中CE1数量最多，其次是GH5；GH5家族成员丰富及在侵染过程中转录水平显著上调表明，其可能在小麦锈菌侵染过程中发挥重要作用。Yang等^［46］研究表明，腐霉菌GH5家族成员Pp07886参与了病原菌的早期感染和寄主的先天免疫诱导。

本研究从未被注释到同源基因簇的叶锈菌PCWDEs挑选出了具有分泌性的基因。利用qRT-PCR检测16个叶锈菌的PCWDEs表达模式后发现，它们在亲和/非亲和互作中均被诱导表达。10个小麦叶锈菌Pt15特异性细胞壁降解酶在亲和、非亲和互作期间都表现出了定殖期间的表达量上升，3个基因在亲和/非亲和互作期间表达模式相反。相比于亲和互作过程，大多数PCWDEs在非亲和互作期间表现为更早的表达响应，说明其在叶锈菌Pt15侵染小麦前期发挥重要作用，且PCWDEs可能在锈菌侵染抗病材料的过程中起到关键作用。在非亲和互作过程中，更多的PCWDEs在72 h达到峰值，其可能与抗病寄主防御反应有关。在小麦条锈菌和秆锈菌的PCWDEs也出现了类似的表达模式，大部分基因在前期表达量较低，这可能与它们活体寄生的生活类型有关，为了避免对寄主造成损伤，72 h上调可能是为了迅速在寄主体内增殖^［47］。PtPL1、PtPL2的底物为果胶，PtAA1的底物为木质素，在本研究中PtPL1、PtPL2比PtAA1更早上调表达， 这可能与它们的作用位点不同有关。但这些基因的作用机制尚不明确，还需进一步试验分析其在小麦-Pt互作过程中发挥的生物学功能及调控机制。

在Pt基因组中鉴定出了4个被注释为PCWDEs的CBM63成员，该家族是具有双结构域的扩展蛋白（expansins，EXPs）的C端结构域^［48］。扩展蛋白是在许多植物发育和生理过程中起到修饰植物细胞壁作用的蛋白，但也可在与寄主互作时由病原菌产生^［49］，有研究推测微生物中的扩展蛋白可能是通过基因水平转移从植物中获得的^［50-51］。微生物的扩展蛋白活性比植物的低，但微生物的扩展蛋白可以影响其对寄主的定殖^［52-53］。本研究鉴定的4种类扩展蛋白均以100的置信度比对到了扩展蛋白TlEXLX1^［54］，表明它们可能具有类似的协同纤维素降解功能，在降解纤维素突破侵染屏障中发挥重要作用，其在致病方面的作用尚需进一步研究。

4　结　论

小麦叶锈菌、条锈菌和秆锈菌分别编码355、322和345个CAZymes家族成员基因以及160、153和158个PCWDEs成员基因。小麦3种锈菌共含86个保守CAZymes基因家族和94个PCWDEs家族直系同源基因簇。叶锈菌特异性PCWDEs基因在亲和/非亲和互作中均受到不同程度的诱导表达，但在非亲和互作中侵染更早期受到诱导上调表达。叶锈菌特异性PCWDEs基因簇中有4个PCWDEs被鉴定为类扩展蛋白，在侵染过程中受到诱导表达，显示其可能在降解纤维素突破小麦防御屏障中发挥重要作用。

参考文献

[1] Zhao J， Kang Z S. Fighting wheat rusts in China： A look back and into the future［J/OL］. Phytopathology Research， （--）. DOI： 10.1186/s42483-023-00159-z

[2] Plotnikova L. Influence of the surface features and physiological reactions of non-host species on the development of cellular structures of rust fungi［J］. Tsitologiia， 2008， 50（5）： 439-446

[3] Zhao Y， Zhu X B， Chen X W， Zhou J M. From plant immunity to crop disease resistance［J］. Acta Genetica Sinica， 2022， 49（8）： 693-703

[4] Wang F， Shen S S， Cui Z C， Yuan S T， Qu P， Jia H， Meng L S， Hao X Y， Liu D Q， Ma L S， Wang H Y. Puccinia triticina effector protein Pt_21 interacts with wheat thaumatin-like protein TaTLP1 to inhibit its antifungal activity and suppress wheat apoplast immunity［J］. The Crop Journal， 2023， 11（5）： 1431-1440

[5] Qi T， Zhu X G， Tan C C， Liu P， Guo J X， Kang Z S， Guo J. Host‐induced gene silencing of an important pathogenicity factor PsCPK1 in Puccinia striiformis f sp tritici enhances resistance of wheat to stripe rust［J/OL］. Plant Biotechnology Journal， （--）. DOI： 10.1111/pbi.12829

[6] Wang N， Tang C L， Fan X， He M Y， Gan P F， Zhang S， Hu Z Y， Wang X D， Yan T， Shu W X， Yu L G， Zhao J R， He J N， Li L L， Wang J F， Huang X L， Huang L L， Zhou J M， Kang Z S， Wang X J. Inactivation of a wheat protein kinase gene confers broad-spectrum resistance to rust fungi［J］. Cell， 2022， 185（16）： 2961-2974

[7] Zhong R Q， Ye Z H. Regulation of cell wall biosynthesis［J］. Current Opinion in Plant Biology， 2007， 10（6）： 564-572

[8] Rafiei V， Vélëz H， Tzelepis G. The role of glycoside hydrolases in phytopathogenic fungi and oomycetes virulence［J/OL］. International Journal of Molecular Sciences， （--）. DOI：10.3390/ijms22179359

[9] Kubicek C P， Starr T L， Glass N L. Plant cell wall-degrading enzymes and their secretion in plant-pathogenic fungi ［J］. Annual Review of Phytopathology， 2014， 52： 427-451

[10] Annis S L， Goodwin P H. Recent advances in the molecular genetics of plant cell wall-degrading enzymes produced by plant pathogenic fungi［J］. European Journal of Plant Pathology， 1997， 103（1）： 1-14

[11] Cantarel B L， Coutinho P M， Rancurel C， Bernard T， Lombard V， Henrissat B. The Carbohydrate-Active EnZymes database （CAZy）： An expert resource for glycogenomics ［J］. Nucleic Acids Research， 2009， 37（1）： 233-238

[12] Tundo S， Paccanaro M C， Bigini V， Savatin D V， Faoro F， Favaron F， Sella L. The Fusarium graminearum FGSG_03624 xylanase enhances plant immunity and increases resistance against bacterial and fungal pathogens［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（19）：1-16

[13] Xu M， Gao X N， Chen J L， Yin Z Y， Feng H， Huang L L. The feruloyl esterase genes are required for full pathogenicity of the apple tree canker pathogen Valsa mali ［J］. Molecular Plant Pathology， 2018， 19（6）： 1353-1363

[14] Yang C， Liu R， Pang J H， Ren B， Zhou H B， Wang G， Wang E T， Liu J. Poaceae-specific cell wall-derived oligosaccharides activate plant immunity via oscerk1 during magnaporthe oryzae infection in rice ［J/OL］. Nature Communications， （--）. DOI： 10.1038/s41467-021-22456-x

[15] Sabbadin F， Urresti S， Henrissat B， Avrova A O， Welsh L R J， Lindley P J， Csukai M， Squires J N， Walton P H， Davies G J， Bruce N C， Whisson S C， McQueen-Mason S J. Secreted pectin monooxygenases drive plant infection by pathogenic oomycetes［J］. Science， 2021， 373（6556）： 774-779

[16] Ökmen B， Jaeger E， Schilling L， Finke N， Klemd A， Lee Y J， Wemhöner R， Pauly M， Neumann U， Doehlemann G. A conserved enzyme of smut fungi facilitates cell-to-cell extension in the plant bundle sheath ［J/OL］. Nature Communications， （--）. DOI： 10.1038/s41467-022-33815-7

[17] Xia C J， Huang L， Huang J， Zhang H， Huang Y， Benhamed M， Wang M N， Chen X M， Zhang M， Liu T G， Chen W Q. Folding features and dynamics of 3D genome architecture in plant fungal pathogens［J/OL］. Microbiology Spectrum， （--）. DOI： https：//doi.org/10.1128/spectrum.02608-22

[18] Li F， Upadhyaya N M， Sperschneider J， Matny O， Nguyen-Phuc H， Mago R， Raley C， Miller M E， Silverstein K A T， Henningsen E， Hirsch C D， Visser B， Pretorius Z A， Steffenson B J， Schwessinger B， Dodds P N， Figueroa M. Emergence of the Ug99 lineage of the wheat stem rust pathogen through somatic hybridisation［J/OL］. Nature Communications， （--）. DOI： 10.1038/s41467-019-12927-7

[19] Li C， Qiao L H， Lu Y N， Xing G Z， Wang X D， Zhang G Y， Qian H M， Shen Y L， Zhang Y B， Yao W， Cheng K， Ma Z L， Liu N， Wang D W， Zheng W M. Gapless genome assembly of Puccinia triticina provides insights into chromosome evolution in Pucciniales［J/OL］. Microbiology Spectrum， （--）. DOI： 10.1128/spectrum.02828-22

[20] Zhang H， Yohe T， Huang L， Entwistle S， Wu P Z， Yang Z L， Busk P K， Xu Y， Yin Y B. dbCAN2： A meta server for automated carbohydrate-active enzyme annotation ［J］. Nucleic Acids Research， 2018， 46（1）： 95-101

[21] Chen C J， Chen H， Zhang Y， Thomas H R， Frank M H， He Y H， Xia R. TBtools： An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］. Molecular Plant， 2020， 13（8）： 1194-1202

[22] Xu L， Dong Z B， Fang L， Luo Y J， Wei Z Y， Guo H L， Zhang G Q， Gu Y Q， Coleman-Derr D， Xia Q Y， Wang Y. OrthoVenn2： A web server for whole-genome comparison and annotation of orthologous clusters across multiple species ［J］. Nucleic Acids Research， 2019， 47（1）： 52-58

[23] Tamura K， Stecher G， Kumar S. MEGA11： Molecular evolutionary genetics analysis version 11［J］. Molecular Biology and Evolution， 2021， 38（7）： 3022-3027

[24] Almagro Armenteros J J， Tsirigos K D， Sønderby C K， Petersen T N， Winther O， Brunak S， von Heijne G， Nielsen H. SignalP 5.0 improves signal peptide predictions using deep neural networks［J］. Nature Biotechnology， 2019， 37（4）： 420-423

[25] Kumari K， Sharma P K， Ma Y， Singh R P. Secretome of Paenibacillus sp S-12 provides an insight about its survival and possible pathogenicity［J］. Folia Microbiologica， 2023， 68（4）： 559-569

[26] Krogh A， Larsson B， von Heijne G， Sonnhammer E L L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model： Application to complete genomes［J］. Journal of Molecular Biology， 2001， 305（3）： 567-580

[27] Bailey T L， Johnson J， Grant C E， Noble W S. The MEME Suite［J］. Nucleic Acids Research， 2015， 43（1）： 39-49

[28] Yang M Z， Derbyshire M K， Yamashita R A， Marchler-Bauer A. NCBI's Conserved Domain Database and tools for protein domain analysis［J/OL］. Current Protocols in Bioinformatics， （--）. DOI： 10.1002/cpbi.90

[29] Mariethoz J， Alocci D， Gastaldello A， Horlacher O， Gasteiger E， Rojas-Macias M， Karlsson N G， Packer N H， Lisacek F. Glycomics@ExPASy： Bridging the gap［J］. Molecular & Cellular Proteomics， 2018， 17（11）： 2164-2176

[30] Kelley L A， Mezulis S， Yates C M， Wass M N， Sternberg M J E. The Phyre2 web portal for protein modeling， prediction and analysis［J］. Nature Protocols， 2015， 10（6）： 845-858

[31] Xie Y B， Li H Q， Luo X T， Li H Y， Gao Q Y， Zhang L W Y， Teng Y Y， Zhao Q， Zuo Z X， Ren J. IBS 2.0： An upgraded illustrator for the visualization of biological sequences［J］. Nucleic Acids Research， 2022， 50（1）： 420-426

[32] Georgelis N， Yennawar N H， Cosgrove D J. Structural basis for entropy-driven cellulose binding by a type-A cellulose-binding module （CBM） and bacterial expansin ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2012， 109（37）： 14830-14835

[33] Sampedro J， Cosgrove D J. The expansin superfamily［J/OL］. Genome Biology， （--）. DOI： 10.1186/gb-2005-6-12-242

[34] Ameri R， García J L， Derenfed A B， Pradel N， Neifar S， Mhiri S， Mezghanni M， Jaouadi N Z， Barriuso J， Bejar S. Genome sequence and Carbohydrate Active Enzymes （CAZymes） repertoire of the thermophilic Caldicoprobacter algeriensis TH 7C1T［J/OL］. Microbial Cell Factories， （--）. DOI： 10.1186/s12934-022-01818-0

[35] Barrett K， Jensen K， Meyer A S， Frisvad J C， Lange L. Fungal secretome profile categorization of CAZymes by function and family corresponds to fungal phylogeny and taxonomy： Example Aspergillus and Penicillium ［J/OL］. Scientific Reports， （--）. DOI： 10.1038/s41598-020-61907-1

[36] Malinovsky F G， Fangel J U， Willats W G T. The role of the cell wall in plant immunity［J/OL］. Frontiers in Plant Science， （--）. DOI： 10.3389/fpls.2014.00178

[37] Nühse T S. Cell wall integrity signaling and innate immunity in plants［J/OL］. Frontiers in Plant Science， （--）. DOI： 10.3389/fpls.2012.00280

[38] Niture S K， Kumar A R， Pant A. Role of glucose in production and repression of polygalacturonase and pectate lyase from phytopathogenic fungus Fusarium moniliforme NCIM 1276［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2006， 22（9）： 893-899

[39] Gupta Y K， Marcelino-Guimarães F C， Lorrain C， Farmer A， Haridas S， Ferreira E G C， Lopes-Caitar V S， Oliveira L S， Morin E， Widdison S， Cameron C， Inoue Y， Thor K， Robinson K， Drula E， Henrissat B， LaButti K， Bini A M R， Paget E， Singan V， Daum C， Dorme C， van Hoek M， Janssen A， Chandat L， Tarriotte Y， Richardson J， Melo B V A， Wittenberg A H J， Schneiders H， Peyrard S， Zanardo L G， Holtman V C， Coulombier-Chauvel F， Link T I， Balmer D， Müller A N， Kind S， Bohnert S， Wirtz L， Chen C， Yan M， Ng V， Gautier P， Meyer M C， Voegele R T， Liu Q L， Grigoriev I V， Conrath U， Brommonschenkel S H， Loehrer M， Schaffrath U， Sirven C， Scalliet G， Duplessis S， van Esse H P. Major proliferation of transposable elements shaped the genome of the soybean rust pathogen Phakopsora pachyrhizi ［J/OL］. Nature Communications， （--）. DOI： 10.1038/s41467-023-37551-4

[40] Dort E N， Layne E， Feau N， Butyaev A， Henrissat B， Martin F M， Haridas S， Salamov A， Grigoriev I V， Blanchette M， Hamelin R C. Large-scale genomic analyses with machine learning uncover predictive patterns associated with fungal phytopathogenic lifestyles and traits［J/OL］. Scientific Reports， （--）. DOI： 10.1038/s41598-023-44005-w

[41] 李闯， 刘娜， 王鑫， 许笑蒙， 申一林， 邢国珍， 康振生， 郑文明. 小麦锈菌碳水化合物酶类基因家族的鉴定与进化分析［J］. 菌物学报， 2017， 36（9）： 1222-1232

[42] Li C， Liu N， Wang X， Xu X M， Shen Y L， Xing G Z， Kang Z S， Zheng W M. Identification and evolutionary analysis of the carbohydrate-active enzymes of the wheat rust fungi［J］. Mycosystema， 2017， 36（9）： 1222-1232 （in Chinese）

[43] 周婷. 受条锈菌侵染后小麦叶片中细胞壁降解酶活性变化的研究［D］. 杨凌：西北农林科技大学， 2008

[44] Zhou T. Studies on the changes of cell wall regrading enzymes in wheat leaves infected by Puccinia striiformis f sp tritici ［D］. Yangling：Northwest A&F University， 2008 （in Chinese）

[45] Duplessis S， Cuomo C A， Lin Y C， Aerts A， Tisserant E， Veneault-Fourrey C， Joly D L， Hacquard S， Amselem J， Cantarel B L， Chiu R， Coutinho P M， Feau N， Field M， Frey P， Gelhaye E， Goldberg J， Grabherr M G， Kodira C D， Kohler A， Kües U， Lindquist E A， Lucas S M， Mago R， Mauceli E， Morin E， Murat C， Pangilinan J L， Park R， Pearson M， Quesneville H， Rouhier N， Sakthikumar S， Salamov A A， Schmutz J， Selles B， Shapiro H， Tanguay P， Tuskan G A， Henrissat B， Van de Peer Y， Rouzé P， Ellis J G， Dodds P N， Schein J E， Zhong S B， Hamelin R C， Grigoriev I V， Szabo L J， Martin F. Obligate biotrophy features unraveled by the genomic analysis of rust fungi［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011， 108（22）： 9166-9171

[46] Voegele R T， Mendgen K W. Nutrient uptake in rust fungi： how sweet is parasitic life？［J］. Euphytica， 2011， 179（1）： 41-55

[47] Mafa M S， Visser B， Boshoff W H P， Kemp G， Alexander O， Castelyn H D. Flagging defensive roles of carbohydrate-active enzymes （CAZymes） and carbohydrates during Puccinia triticina -wheat interactions ［J/OL］. Physiological and Molecular Plant Pathology， （--）. DOI： 10.1016/j.pmpp.2023.101947

[48] Yang H C， Weng P W， Liu Z D， Yan Y W， Tang L， Li J， Mao Y X， Mo Z L. Glycoside hydrolase family 5 gene Pp07886 in Pythium porphyrae ： Identification， characterization， expression pattern， and activation of the host immunity ［J/OL］. Algal Research， （--） . DOI： 10.1016/j.algal.2023.103090

[49] 裴国亮. 小麦条锈菌蛋白激酶及细胞壁降解酶基因家族的比较基因组学分析［D］. 杨凌：西北农林科技大学， 2018

[50] Pei G L. Comparative genomics analysis on the gene families of kinases and cell wall degrade enzymes in Puccinia striiformis f sp tritici ［D］. Yangling：Northwest A&F University，2018 （in Chinese）

[51] Cosgrove D J. Plant expansins： Diversity and interactions with plant cell walls［J］. Current Opinion in Plant Biology， 2015， 25： 162-172

[52] Narváez-Barragán D A， Tovar-Herrera O E， Guevara-García A， Serrano M， Martinez-Anaya C. Mechanisms of plant cell wall surveillance in response to pathogens， cell wall-derived ligands and the effect of expansins to infection resistance or susceptibility ［J/OL］. Frontiers in Plant Science， （--）.DOI： 10.3389/fpls.2022.969343

[53] Chase W R， Zhaxybayeva O， Rocha J， Cosgrove D J， Shapiro L R. Global cellulose biomass， horizontal gene transfers and domain fusions drive microbial expansin evolution［J］. The New Phytologist， 2020， 226（3）： 921-938

[54] Nikolaidis N， Doran N， Cosgrove D J. Plant expansins in bacteria and fungi： Evolution by horizontal gene transfer and independent domain fusion［J］. Molecular Biology and Evolution， 2014， 31（2）： 376-386

[55] Liu J， Peng H， Cui J K， Huang W K， Kong L A， Clarke J L， Jian H， Wang G L， Peng D L. Molecular characterization of a novel effector expansin-like protein from Heterodera avenae that induces cell death in Nicotiana benthamiana ［J/OL］. Scientific Reports， （--）. DOI： 10.1038/srep35677

[56] Pi L， Yin Z Y， Duan W W， Wang N， Zhang Y F， Wang J H， Dou D L. A G-type lectin receptor-like kinase regulates the perception of oomycete apoplastic expansin-like proteins ［J］. Journal of Integrative Plant Biology， 2022， 64（1）： 183-201

[57] Ding S J， Liu X Q， Hakulinen N， Taherzadeh M J， Wang Y R， Wang Y， Qin X， Wang X L， Yao B， Luo H Y， Tu T. Boosting enzymatic degradation of cellulose using a fungal expansin： Structural insight into the pretreatment mechanism［J/OL］. Bioresource Technology， （--） DOI： 10.1016/j.biortech.2022.127434

基金资助

国家重点研发计划(2021YFD1401000)

河南省重大科技专项(221100110100)

河南农业大学拔尖人才项目(30500924)