贝莱斯芽孢杆菌和戊糖片球菌联合使用对饲喂霉变饲料肉鸡生产性能和肠道损伤的影响

Effect of combined use of Bacillus velezensis and Pediococcus pentosaceus on the production performance and intestinal damage of broilers fed with moldy feed

摘要

为分析贝莱斯芽孢杆菌与戊糖片球菌联合使用对饲喂霉变饲料肉鸡的生产性能与肠道损伤的影响，本研究选取96只1日龄白羽肉鸡公雏，随机平均分为空白组、攻毒组、益生菌组和解毒组。每组3个重复，每个重复8只鸡，试验周期为21 d。统计并比较分析不同组肉鸡体重、采食量、料重比；利用ELISA检测血清生化指标的变化；应用荧光定量PCR法检测空肠组织紧密连接蛋白和炎症因子mRNA表达水平的变化；应用病理组织学观察各组肉鸡肠道结构的变化。结果表明： 1）与攻毒组相比，解毒组21日龄肉鸡的体重、平均采食量和平均日增重均显著高于攻毒组（P<0.05）。2）与攻毒组相比，解毒组肉鸡的血清SOD活性、GSH-px活性和MDA含量显著降低（P<0.05），T-AOC含量极显著升高（P<0.01），各项血清生化指标均显著回调（P<0.05）。3）与攻毒组相比，解毒组肉鸡空肠绒毛形态显著改善，空肠组织中CIT含量极显著升高（P<0.01），DAO、D-乳酸和IFABP含量均发生极显著降低（P<0.01）。4）与攻毒组相比，解毒组肉鸡空肠紧密连接蛋白相关基因闭锁蛋白1（ZO-1），闭合蛋白（Occludin）和紧密连接蛋白1（Claudin-1）的mRNA表达水平极显著上升（P<0.01）。5）与攻毒组相比，解毒组肉鸡空肠炎症因子白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的mRNA表达水平均发生极显著回调（P<0.01），白介素1（IL-1）的mRNA表达水平均发生显著回调（P<0.05）。综上，贝莱斯芽孢杆菌和戊糖片球菌联合使用可改善霉变饲料造成的肉鸡生产性能下降，减轻霉变饲料导致的肉鸡肠道形态学改变、屏障损伤与炎症反应。本研究为生产实践中联合使用这2株益生菌作为饲料添加剂防控畜禽霉菌毒素中毒提供理论和实践基础。

Abstract

To analyze the effects of the combination of Bacillus subtilis and Pediococcus pentosaceus tablets on the performance and intestinal damage of broilers fed moldy feed， 96 1-day-old white feather broiler male chicks were randomly divided into a blank group， an attack group， a probiotic group and a detoxification group. Each group had 3 replicates， each with 8 chicks， and the test period was 21 d. The changes in body weight， feed intake and feed-to-weight ratio of broilers in different groups were counted and compared. Changes in serum biochemical indexes were detected by ELISA， and changes in the expression levels of proteins of the jejunum and inflammatory factor mRNA were detected by fluorescence PCR， and changes in the intestinal structure of broilers were observed by histopathology. The results showed that： 1） Compared with the attack group， the body weight， average feed intake， and average daily weight gain of 21-day-old broilers in the detoxification group were significantly higher （P<0.05）. 2） Compared with the attack group， the serum SOD activity， GSH-px activity and MDA content of broilers in the detoxification group were significantly decreased （P<0.05）， the T-AOC content was highly significantly increased （P<0.01）， and all the serum life indexes were significantly regressed （P<0.05）. 3） Compared with the attack group， the morphology of jejunal villi of broilers in the detoxification group was significantly improved， the citrulline （CIT） content in jejunal tissues was highly significantly elevated （P<0.01）， and highly significant reductions in the contents of diamineoxidase （DAO）， D-lactic acid and intestinal fatty acid binding protein （IFABP） occurred （P<0.01）. 4） The mRNA expression levels of the jejunal tight junction protein-related genes occludin 1 （ZO-1）， occludin and claudin-1 were highly significantly increased in the detoxification group compared with the attack group （P<0.01）. 5） Compared with the attack group， the mRNA expression levels of the broiler jejunal inflammatory factors IL-6， IL-8 and TNF-α were all highly significantly （P<0.01） retuned in the detoxification group， and the mRNA expression level of IL-1β， was significantly （P<0.05） retuned in the detoxification group. In conclusion， the combined use of Bacillus subtilis and Pediococcus pentosaceus can improve the decline in broiler performance caused by moldy feed， reduce the morphological changes， barrier damage and inflammatory response of the intestinal tract of broilers caused by moldy feed. This study can provide a theoretical and practical basis for the combined use of these two probiotics as feed additives in production practice to prevent and control mycotoxin poisoning.

Graphical abstract

关键词

霉菌毒素 / 益生菌 / 肉鸡 / 空肠炎症 / 肠道屏障

Key words

mycotoxins / probiotics / broilers / jejuno-intestinal inflammation / intestinal barrier

益生菌常作为饲料添加剂用于畜禽。益生菌具有许多益生作用，主要包括杀死或抑制致病菌、抗病毒、调节免疫反应，改善肠道菌群，增强肠道屏障功能，促进营养利用等作用^［1-2］。近年来，研究发现益生菌具有吸附或降解霉菌毒素作用。如蔬菜芽孢杆菌F6在体外脱毒黄曲霉毒素B1（AFB1）的能力达到83%^［3］，解淀粉芽孢杆菌G-6能够100%降解可溶性淀粉、玉米粉、豆粕粉中的玉米赤霉烯酮（ZEA）^［4］。据报道很多益生菌可降低真菌毒素对动物机体造成的损伤。如鼠李糖乳杆菌RC007可降低脱氧雪腐镰刀菌烯醇对猪空肠毒性^［5］，枯草芽孢杆菌ANSB168可减轻赭曲霉毒素A（OTA）引起的肉鸡免疫损伤和炎症^［6］。本实验室分离鉴定的贝莱斯芽孢杆菌A2可以对ZEA造成小鼠的肝肾损伤起到保护作用^［7-8］。同时分离鉴定的戊糖片球菌xy46也已被证明可以缓解ZEA对雄性小鼠生殖系统造成的生殖毒性^［9］。但目前关于益生菌联合使用对于动物霉菌毒素中毒的防控作用的相关研究还较少。同时，霉菌毒素造成的污染通常不是单一类型，而是混合类型。因此，本研究将本实验室分离鉴定的具有脱毒效果的2种益生菌联合使用，探讨能否降低霉菌毒素对肉鸡生长性能以及肠道损伤的影响，该研究为今后联合使用益生菌株来拮抗饲料中霉菌毒素引发的畜禽中毒奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1　试验菌株

赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus AS3.3876， AO）分离株购于广东省微生物研究所。禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum 3.4521）和黄曲霉（Aspergillus flavus3.4408）购于中国科学院微生物研究所。益生菌株由沈阳农业大学动物科学与医学学院临床教研室提供。贝莱斯芽孢杆菌A2（中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2018352），戊糖片球菌xy46（中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2018363）。经测定，本批次含贝莱斯芽孢杆菌A2活菌数9×10⁸ CFU/g（芽孢形成率93.6%），戊糖片球菌xy46活菌数9×10⁸ CFU/g。由2株菌按照1∶1比例进行混合，活菌数为9×10⁸ CFU/g。

1.2　发霉饲料制备及毒素含量测定

将基础饲粮粉碎后，在105 ℃的烘箱干燥灭菌48 h，均匀平铺于灭菌室地板，厚度约8 cm，分别接种赭曲霉、黄曲霉和禾谷镰刀菌的分生孢子悬浮液，并在30 ℃间温育14 d，每天将0.3 L高压灭菌的无血清细胞培养基（CDM）与0.7 L超纯水混合，每日分早晚2次喷洒接种到3 kg饲料粉并混匀。除赭曲霉菌外，所有操作均在无菌环境中穿着防护服进行。培养第21 天后终止培养，收集发霉的饲料粉，并在120 ℃高压灭菌15 min。霉菌毒素组饲粮配制时通过梯度稀释法进行。发霉饲料经甲醇抽提后，分别通过V_甲醇∶V_水∶V_冰醋酸=99∶99∶2、V_甲醇∶V_水=100∶100）、V_甲醇∶V_水=80∶20的流动相浸提后采用高效液相色谱法定量测定OTA、AFB1和ZEA3种霉菌毒素的含量。经高效液相色谱法测定，本次制备的饲料中含OTA为2.76 mg/kg（高于中国标准限量0.10 mg/kg和欧盟标准限量0.25 mg/kg），AFB1为1.52 mg/kg（高于中国标准限量0.05 mg/kg和欧盟标准限量0.02 mg/kg）和ZEA为4.62 mg/kg（高于中国标准限量0.5 mg/kg和欧盟标准限量2 mg/kg）。

1.3　试验设计

选用96只1日龄健康的初始体重为（（40±0.5） g）的白羽肉鸡公雏（沈阳禾丰牧业有限公司），随机平均分为4组，每组3个重复，每个重复8只鸡。试验期为21 d。处理A为空白组，饲喂正常饲粮。处理B组为益生菌对照组，饲喂正常日粮和添加量为0.7%的益生菌。处理C组为攻毒组，给予饲喂发霉饲料（发霉饲料含霉菌毒素的浓度见1.2）。处理D组为解毒组，饲喂发霉饲料中添加量为0.7%的益生菌。肉仔鸡自由采食，充足饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。

1.4　样品采集

21日龄时，每只肉鸡采用翅根静脉采血1 mL，37 ℃静置凝血，分离血清备用。之后处死所有处理组肉鸡，取空肠组织，每组随机选取6只肉鸡将其组织部分放入4%的多聚甲醛中浸泡充分固定24 h后，用于HE染色。剩余部分组织经预冷PBS冲洗后，迅速过液氮保存于-80 ℃冰箱。

1.5　检测指标及方法

1.5.1　生长性能测定

试验开始和结束时，对肉鸡进行空腹称重，计算平均日增重。试验期间，每天7：00之前称量添加的饲料，每日晚上19：00称量剩余的饲料量，计算平均日采食量，根据平均日采食量，计算料重比。

1.5.2　肉鸡空肠组织病理学测定

每组随机选择6只肉鸡，并取出空肠组织。利用石蜡包埋、切片、HE常规染色。并用光学显微镜观察各组肉鸡空肠组织形态变化，并进行拍照记录和分析。

1.5.3　血清生化指标测定

血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）含量。本试验具体操作步骤严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒的说明书进行操作。

1.5.4　空肠组织屏障指标测定

取1 g肉鸡空肠组织使用组织匀浆仪进行组织匀浆，检测肉鸡空肠组织中的瓜氨酸（CIT）、肠型脂肪酸结合蛋白（IFABP）、D-乳酸和二胺氧化酶（DAO）含量，评估肉鸡肠道损伤程度。本试验严格按照BMASSAY试剂盒的说明书进行操作。

1.5.5　空肠组织炎症因子与紧密连接基因mRNA表达水平的测定

根据诺唯赞生物科技股份有限公司提供的总RNA提取试剂盒说明书提取肉鸡空肠组织总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录，以及qPCR试剂盒进行qPCR反应，检测Occludin、ZO-1、Claudin-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、内参基因β-actin的表达水平，反应条件如下：95 ℃预变性30 s，循环反应40次：95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，95 ℃，15 s。数据结果采用2^-ΔΔCt法表达试验组相对于空白对照组的mRNA表达水平的变化。所需引物均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

1.6　数据统计分析

是采用SPSS 26.0进行单因素方差分析和一般线性模型单变量双因素方差分析处理，并用Duncan氏和LSD法进行多重比较，结果用平均值±标准差表示。血清生化指标、空肠组织屏障指标、紧密连接蛋mRNA表达水平和炎性因子mRNA表达水平的数据经由分析软件SPSS 26.0进行One Way ANOVA单因素方差分析，经Excel进行统计与计算，绘制出图表。结果用平均值±标准误表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1　益生菌联合使用对肉鸡生长性能的影响

如表2所示，与空白组相比，攻毒组21日龄肉鸡体重、平均日采食量、平均日增重均显著低于空白组。与攻毒组相比，解毒组21日龄肉鸡体重显著高于攻毒组（P<0.05），并接近空白组，同时，解毒组肉鸡平均日采食量、平均日增重均显著高于攻毒组（P<0.05）。值得注意的是，与空白组相比，益生菌组试验肉鸡21日龄体重、平均日采食量、平均日增重均显著高于空白组（P<0.05）。但四组肉鸡料重比无显著差异。结果表明，2株益生菌的联合使用，降低了发霉饲料中真菌毒素对肉鸡生产性能的影响。

2.2　益生菌联合使用对肉鸡空肠组织形态的影响

肉鸡空肠组织HE染色结果如图1所示。空白组肉鸡空肠肠腺结构在固有层排列整齐，无明显断裂，空肠绒毛形态完整规律（图1（a））。益生菌组无任何异常出现，较为接近空白组（图1（b））。与对照组相比，饲喂发霉饲料的肉鸡，绒毛排列不规律，甚至断裂。此外，攻毒组空肠组织可见大量出血点，同时存在炎性细胞浸润（图1（c））。可见肠隐窝深度增长（P<0.01），肠绒毛长度缩短（P<0.01）（图2），解毒组与攻毒组相比，空肠绒毛形态得到显著改善，虽然仍存在少量出血点，但是无其他异常（图1（d））。说明2株益生菌的联合使用，降低了发霉饲料中真菌毒素对肉鸡肠道形态的损伤。

2.3　益生菌联合使用对肉鸡血清生化指标的影响

如图3所示，与空白组相比，攻毒组中21日龄肉鸡血清SOD活性（P<0.01）和T-AOC含量极显著降低（P<0.01），GSH-px活性（P<0.01）和MDA含量极显著升高（P<0.01）。与攻毒组相比，解毒组肉鸡血清SOD活性、GSH-px活性和MDA含量显著降低（P<0.05），T-AOC含量极显著升高（P<0.01），各项血清生活指标均有显著回调。值得注意的是，益生菌组与空白组相比无显著变化，甚至益生菌组中GSH-px活性略微升高。说明2株益生菌的联合使用，降低了发霉饲料中霉菌毒素对肉鸡的氧化损伤。

2.4　益生菌联合使用对肉鸡空肠组织屏障指标的影响

如图4所示，与空白组相比，攻毒组中肉鸡空肠组织中CIT含量极显著降低（P<0.01），DAO、D-乳酸和IFABP含量均发生极显著升高（P<0.01）。与攻毒组相比，解毒组空肠组织CIT含量极显著升高（P<0.01），DAO、D-乳酸和IFABP含量均发生极显著降低（P<0.01）。此外，解毒组与空白组相比，饲料中添加益生菌后能够极显著降低空肠IFABP含量（P<0.01）。结果说明，发霉饲料引起空肠组织屏障损伤，而添加2株益生菌后，显著缓解了霉菌毒素对空肠组织屏障损伤。

2.5　益生菌联合使用对空肠组织紧密连接蛋白mRNA表达水平的影响

如图5所示，与空白组相比，益生菌组的ZO-1相对mRNA表达量极显著升高（P<0.01），攻毒组的ZO-1相对mRNA表达量无显著差异。与攻毒组相比，解毒组的ZO-1相对mRNA表达量发生极显著上调（P<0.01）；与空白组相比，攻毒组的Occludin相对mRNA表达量极显著下调（P<0.01），但是解毒组的Occludin的相对mRNA表达量得到极显著回调（P<0.01），接近空白组；添加益生菌组的相对表达量与空白组相当。与空白组相比，攻毒组的Claudin-1相对mRNA表达量极显著下调（P<0.01），而解毒组与攻毒组相比相对表达量极显著上调（P<0.01）。结果说明，发霉饲料引起空肠组织上皮细胞紧密连接损伤，而添加2株益生菌后，显著缓解了霉菌毒素对空肠组织上皮细胞紧密连接损伤。

2.6　益生菌联合使用对肉鸡空肠炎症因子mRNA表达水平的影响

如图6所示，与空白组相比，食用发霉饲料的攻毒组肉鸡空肠炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平均发生极显著升高（P<0.01）。此外，与攻毒组相比，解毒组的炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平均发生极显著回调（P<0.01），炎症因子IL-1β的mRNA表达水平发生显著回调（P<0.05），接近空白组水平。由此可见，2株益生菌株联合使用可抑制肉鸡食用发霉饲料引起的空肠炎症反应。

3　讨论

3.1　益生菌联合使用对食用发霉饲料肉鸡生产性能的影响

目前，饲料中霉菌毒素污染现象非常普遍，但霉菌毒素在饲料中并不是单独存在，而是多种并存，危害要比单一毒素更为严重^［10］。因此，使用多种毒素共同污染的饲料作为研究更为切合实际。本研究使用发霉饲料中含有的3种毒素，AFB1，OTA和ZEA是饲料中最为常见的霉菌毒素^［11］。研究表明，多种霉菌毒素同时存在可降低动物的生长性能，对畜禽脏器造成严重损伤^［12］。本研究表明，这3 种毒素的存在可严重影响肉鸡的生产性能，对肠道造成严重损伤，这与前人研究结果一致^［13-14］。研究表明，霉菌毒素AFB1和ZEA联合使用，降低了肉鸡生产性能，但饲粮中同时添加枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和假丝酵母菌提高了肉鸡采食量，提高了肉鸡生产性能^［15］。研究发现，AFB1降低了肉鸡生产性能和血清生化指标，而饲喂唾液乳杆菌不仅仅能够改善肉鸡健康，提高生产性能，还能消除AFB1的毒性作用^［16］。本研究结果表明，饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌和戊糖片球菌后，也显著提高了由于霉菌毒素对肉鸡造成的生产性能下降。这进一步证明，饲料中添加益生菌可以拮抗霉菌毒素造成的肉鸡生产性能下降。

3.2　益生菌联合使用对食用发霉饲料肉鸡肠道屏障损伤的影响

DAO、IFABP、D-乳酸和瓜氨酸都可以作为肠道屏障障碍的预警指标^［17］。当肠粘膜屏障受损时，血清DAO、IFABP和D-乳酸水平会升高^［17］。本研究结果显示，与空白组相比，肉鸡食用被霉菌毒素污染的饲料后，其血浆中DAO、D-乳酸和IFABP的含量明显升高，CIT的含量明显降低说明了霉菌毒素对肉鸡肠道屏障造成损伤。研究结果表明， AFB1可升高肉鸡血浆中DAO的水平^［18］，镰刀菌霉菌毒素会造成仔猪血浆中DAO和D乳酸的含量升高^［19］。有研究表明，山羊暴露于AFB1后会引起代谢途径的内源性的代谢变化，其中血清中瓜氨酸的含量降低^［20］。同样，本研究中攻毒组DAO、IFABP和D-乳酸指标的上升，CIT的含量降低，说明AFB1、OTA和ZEA可造成肉鸡肠道通透性增加，使DAO、IFABP和D-乳酸释放入血，说明了霉菌毒素对肉鸡肠道屏障造成损伤。但经过益生菌干预后，血浆内DAO、IFABP和D-乳酸水平显著下降，CIT的含量上升，说明益生菌对霉菌毒素肠道粘膜屏障损伤的起到了保护作用。

肠道机械屏障由肠道黏液层、肠上皮细胞以及细胞间紧密连接和黏膜下固有层与菌膜三者构成。其中肠上皮细胞的屏障功能由细胞间紧密连接的通透性所决定^［21］。肠道上皮细胞的紧密连接由几种跨膜和胞质蛋白组成，主要包括Occludin、ZO-1和Claudin-1 3 种蛋白。霉菌毒素可通过改变肠道紧密连接蛋白的表达水平导致肠道机械屏障功能受损^［22］。研究发现，AFB1可降低Claudin-1和ZO-1蛋白表达^［23］，OTA能够降低小鼠盲肠的紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1和Occludin的表达水平^［24］。本研究结果表明，肉鸡食用被多种霉菌毒素污染的饲料后，Occludin、ZO-1和Claudin-1的mRNA表达量显著降低，说明饲料中含有AFB1、OTA和ZEA造成了肉鸡空肠机械屏障损伤。而通过饲喂益生菌后，与攻毒组相比，3 种紧密连接蛋白的mRNA表达量显著上升，说明益生菌能够缓解由霉菌毒素造成的肠道紧密连接损伤，降低了霉菌毒素对肠道机械屏障损伤。

3.3　益生菌联合使用拮抗发霉饲料引起肉鸡生产性能下降和肠道损伤作用机制探讨

研究表明，许多益生菌株的使用可以降低霉菌毒素对畜禽的危害。本研究所使用的两株益生菌一株是贝莱斯芽孢杆菌A2，该菌株已被证明具有降解玉米赤霉烯酮作用，能够缓解玉米赤霉烯酮对小鼠肾脏的毒性作用^［7］，另外一株是戊糖片球菌xy46，该菌株也被证明对玉米赤霉烯酮引起的小鼠生殖系统毒性有很好的拮抗作用^［9］。通过本研究证明，这两株菌联合使用有效的拮抗了发霉饲料引起的肉鸡生产力下降和肠道损伤。这可能由于贝莱斯芽孢杆菌A2能够降解这3 种霉菌毒素，戊糖片球菌xy46能够吸附这3种毒素，进而降低了霉菌毒素的浓度进而减轻对肠道的损伤。此外，贝莱斯芽孢杆菌和戊糖片球菌均能够提高机体的抗氧化能力，提高肠道抗氧化能力，提高肠道上皮细胞活力^［25-26］，进而降低霉菌毒素对肠道的氧化损伤。贝莱斯芽孢杆菌提高机体的抗氧化能力可能与其产生的胞外多糖有关^［27］，还与其能够通过分泌抗菌肽调控细胞Nrf2信号通路有关^［28］，而戊糖片球菌可以通过其细胞表面的多糖或者磷壁酸等能够清除机体细胞的自由基，进而防止机体细胞过氧化^［29］，还可以通过调控Nrf2-Keap1抗氧化信号通路^［30］起到抗氧化作用。另外一个重要原因，贝莱斯芽孢杆菌和戊糖片球菌调控了肠道菌群^［31-32］，增加了肠道益生菌的种类和数量，进而起到降低霉菌毒素对肠道的氧化损伤和炎症反应。因此，本研究尚有不足之处，未能测定肠道菌群的变化情况。同时，接下来可以通过细胞试验来揭示这两株菌提高肠道上皮细胞抗氧化能力的分子机制，降低霉菌毒素对肠上皮细胞损伤的分子机制。

4　结论

贝莱斯芽孢杆菌A2和戊糖片球菌xy46联合使用能拮抗发霉饲料造成肉鸡肠道屏障损伤，并且减轻由霉菌毒素造成的肠道炎症反应，改善因霉变饲料所导致的肉鸡生产性能下降。

本研究为利用贝莱斯芽孢杆菌A2和戊糖片球菌xy46作为饲料添加剂防控霉菌毒素中毒奠定基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32273074)

国家自然科学基金项目(31972746)

国家自然科学基金项目(31872538)

国家自然科学基金项目(31772809)

辽宁省教育厅重点项目(LJKZ0632)