FOXO1基因调控牛前体脂肪细胞增殖和分化的功能研究

Study on the function of FOXO1 gene in regulating the proliferation and differentiation of bovine preadipocytes

摘要

为探究干扰叉头转录因子O1（Forkhead box protein O1， FOXO1）对牛前体脂肪细胞增殖和分化的作用，本研究以固原黄牛的前体脂肪细胞为研究对象，采用组织块法分离牛前体脂肪细胞，并利用表型鉴定和标志基因表达谱2种方法鉴定所分离细胞的纯度和分化潜能。筛选并包装牛FOXO1干扰慢病毒，利用EdU染色、流式细胞术、油红O染色和qPCR方法探究干扰FOXO1对牛脂肪细胞增殖和分化的作用。结果表明：1）成功分离了牛前体脂肪细胞，且其具有较高的纯度和分化潜能。2）EdU染色结果表示，侵染Lv-FOXO1极显著增加了牛脂肪细胞的增殖率（P<0.01）。3）流式周期结果显示，干扰FOXO1显著增加了牛脂肪细胞S期阳性细胞的比例，促进了G1/S期的转化，进而促进了牛脂肪细胞增殖。4）干扰FOXO1后，增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达量均极显著上调（P<0.01）。5）干扰FOXO1后牛前体脂肪细胞脂滴生成明显减少，且成脂标志基因PPARG的表达极显著下调（P<0.01），CEBPB和LPL的表达显著下调（P<0.05）。综上，干扰FOXO1可通过上调增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达促进牛脂肪细胞G1/S期的转化，进而促进牛脂肪细胞增殖，且其可通过降低成脂标志基因PPARG、CEBPB和LPL的表达减少牛脂肪细胞脂滴形成，进而影响脂肪沉积。本研究可为中国地方黄牛的肉质遗传改良提供理论依据。

Abstract

The aim of the study was to investigate the effects of interfering with Forkhead box protein O1（FOXO1） gene on the proliferation and differentiation of bovine preadipocytes. Taking the Guyuan cattle preadipocytes as the research object， bovine preadipocytes were isolated by tissue block method， and the purity and differentiation potential of the isolated cells were identified by phenotypic identification and marker gene expression profiling. The bovine FOXO1 interfering lentivirus was screened and packaged， and the effects of interfering FOXO1 on the proliferation and differentiation of bovine adipocytes were explored by EdU staining， flow cytometry， oil red O staining and qPCR. The results showed that： 1） The bovine preadipocytes were successfully isolated and showed high purity and differentiation potential. 2） EdU staining showed that infection of Lv-FOXO1 significantly increased the proliferation rate of bovine adipocytes （P<0.01）. 3） Flow cytometry results showed that interfering with FOXO1 significantly increased the proportion of S-phase positive cells and promoted the G1/S phase transformation of bovine adipocytes， which in turn promoted the proliferation of bovine adipocytes. 4） After interfering with FOXO1， the expression levels of proliferation marker genes PCNA， CDK1 and CDK2 were all extremely significantly upregulated （P<0.01）. 5） After interfering with FOXO1， the production of lipid droplets in bovine precursor adipocytes was significantly reduced， and the expression of PPARG， a lipid-forming marker gene， was extremely significantly down-regulated （P<0.01）， together with the expressions of CEBPB and LPL （P<0.05）. In summary， interfering with FOXO1 can promote the G1/S phase transformation of bovine adipocytes by up-regulating the expressions of proliferation marker genes PCNA， CDK1 and CDK2， thereby promoting the proliferation of bovine adipocytes. Moreover， it can reduce the formation of lipid droplets in bovine adipocytes by reducing the expressions of lipogenic marker genes PPARG， CEBPB and LPL， thus affecting fat deposition. This study can provide theoretical basis for genetic improvement of meat quality of Chinese local yellow cattle.

Graphical abstract

关键词

FOXO1 / 固原黄牛，前体脂肪细胞 / 增殖 / 分化

Key words

FOXO1 / Guyuan cattle， preadipocytes / proliferation / differentiation

在动物生产中，肌内脂肪的含量与肉品质的好坏密切相关^［1］。脂肪的生长发育是一个复杂但协调的生物学过程，其起源于中胚层体节的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells， MSCs），经前体脂肪细胞的终末分化等过程最终形成成熟的脂肪细胞^［2-3］。在脂肪生成的过程中，以过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（Peroxisome proliferators activated receptors γ， PPARG）为核心所组成的复杂分子调控网络对前体脂肪细胞的增殖和分化发挥重要作用^［3］，各调控因子间相互作用，共同推动脂肪生成的进程。然而，涉及脂肪生成的许多潜在靶点尚未发现或其作用机制尚不明晰。因而，发掘调控脂肪生成的关键基因，完善脂肪生成的分子调控网络，对畜牧业的肉质遗传改良而言有着重要意义。

叉头转录因子O1（Forkhead box protein O1， FOXO1）是胰岛素反应组织（如脂肪，肌肉和肝脏等）中最丰富的FoxO亚型，其活性经由蛋白激酶B（Protein kinase B， AKT）介导的磷酸化和核排斥而受到胰岛素和生长因子的负调节^［4-6］。FOXO1可通过磷酯酰肌醇3激酶/AKT（Phosphoinositide 3-kinase/AKT， PI3K/AKT）和细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinase/Mitogen activated protein kinase， ERK/MAPK）通路间接调控3T3-L1细胞分化^［7-8］，但其在分化早期并不会在生理上抑制脂肪细胞分化，因为它的转录活性被AKT所介导的磷酸化所抑制^［9］。另一方面，FOXO1的转录活性还可通过乙酰化和去乙酰化调节^［6］。Matsuzaki等^［10］报道，FOXO1的乙酰化会导致其DNA结合活性下降和对AKT依赖性磷酸化更敏感。在3T3-L1细胞中，SIRT2（Sirtuin 2）的敲低可增加FOXO1乙酰化，进而降低FOXO1对脂肪发生的抑制作用并促进脂肪细胞的分化^［6］。因而，FOXO1可通过磷酸化/去磷酸化和乙酰化/去乙酰化作用调控脂肪生成。此外，FOXO1可通过调节脂肪细胞的大小和脂肪特异性基因（如ATGL）的表达来调节小鼠脂肪组织的脂质代谢^［11］。以上研究进一步说明，FOXO1在脂肪的生成中发挥重要作用。

目前，现有的研究主要集中在小鼠脂肪细胞分化和脂质代谢方面，FOXO1对牛脂肪细胞增殖和分化的调控作用尚不明晰。因此，本研究以牛前脂肪细胞为研究对象，通过干扰FOXO1基因的表达，确定FOXO1基因在牛脂肪细胞增殖、分化和脂质代谢中的作用，以期阐明FOXO1对牛脂肪生成和沉积的调控作用机制，为改善牛肉品质提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　试验试剂

DMEM/high glucose、PBS、penicillin/streptomycin和胰酶等购自Hyclone公司（Logan， Utah， USA）；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）和Lipofectamine^TM 3 000购自Invitrogen公司（Carlsbad， USA）；罗格列酮、IBMX（3-isobutyl-1-methyl-7H-xanthine）和地塞米松购自Sigma-aldrich公司（St. Louis， USA）；Trizol和Prime Script™ RT reagent Kit with gDNA Eraser购自Takara公司（Shiga， Japan）；Bodipy 493/503购自安捷凯生物医药科技有限公司（武汉）；油红O购自Solarbio公司（北京）；2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq购自Mei5bio公司 （北京）；BeyoClick^TM EdU-555细胞增殖检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒与QuickBlock^TM免疫染色封闭液购自Beyotime Biotechnology公司（上海）；无水乙醇、甲醛、氯仿和异丙醇等均为国产分析纯。

1.1.2　试验样品采集

本研究用于分离前体脂肪细胞的组织样采自3只健康状况良好，无血缘关系的1周龄固原黄牛公犊牛皮下脂肪。试验牛只经75%酒精消毒，用PBS溶液（含1% Penicillin/Streptomycin）清洗数次后，利用无菌手术器械采集其脂肪组织，最后置于PBS溶液（含1% Penicillin/Streptomycin）中带回细胞室。

1.2　试验方法

1.2.1　牛原代前体脂肪细胞的分离、培养与鉴定

本研究采用组织块法^［12］分离牛原代前体脂肪细胞（以下简称脂肪细胞）。首先，采集的脂肪组织用PBS（含1% penicillin/streptomycin）清洗3次后，利用无菌器械剔除血管、肌肉和结缔组织等，将脂肪组织剪成小块，并接种于胶原包被的培养皿中。于细胞培养箱（37 ℃、5%CO₂）倒置培养6 h后，加入生长培养基（10% FBS+1% penicillin/streptomycin + 89% DMEM/high glucose）继续培养。待组织块周围长出大量脂肪细胞后，挑出组织块，继续培养至细胞汇合度达80%左右时，进行扩大培养。采用表型鉴定（油红O染色和Bodipy染色）和标志基因表达谱鉴定2种方法鉴定所分离牛脂肪细胞的纯度和分化潜能。

1.2.2　油红O染色和Bodipy染色

将F3代密度适宜的牛脂肪细胞（n=3）铺至6孔板中，待细胞汇合度达100%左右时，将培养基更换为诱导分化培养基（DMEM/high glucose+10 μg/mL胰岛素+0.5 mmol/L IBMX+1 μmol/L罗格列酮+1 μmol/L地塞米松），此时记为分化0 d。诱导分化2 d后换为维持培养基（DMEM/high glucose+10 μg/mL胰岛素+1 μmol/L罗格列酮）继续培养。每2 d换液一次，培养至分化8 d进行油红O染色和Bodipy染色。

油红O染色：首先将分化8 d脂肪细胞用PBS溶液清洗3次；利用4%多聚甲醛固定，室温孵育1 h；随后用60%异丙醇清洗，静置5 min，待培养皿完全干燥后加入配制好的油红O工作液（油红O储备液∶PBS=3∶2配制），并于室温条件下孵育30 min（避光）；最后，弃油红O工作液，并经PBS清洗后在显微镜（OLYMPUS， Tokyo， Japan）下进行成像观察，并拍照记录。

Bodipy染色：利用4%多聚甲醛溶液固定分化第8天的牛脂肪细胞60 min；利用PBS溶液对Bodipy储存液（5 μmol/L）进行稀释获得Bodipy工作液；每孔细胞添加500 μL Bodipy工作液，于室温条件下避光染色30 min；PBS洗3次后，利用DAPI染液染核10 min；PBS洗3次后，于IX71倒置荧光显微镜（OLYMPUS）下进行成像观察，并拍照记录。

1.2.3　实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）

采用Trizol法提取牛脂肪细胞RNA。参照Prime Script™ RT reagent Kit with gDNA Eraser说明书将检测合格的总RNA反转录为cDNA，于-20 ℃保存备用。使用2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq荧光定量试剂盒对增殖和分化标志基因进行实时定量检测。定量引物利用由通用生物技术有限公司（安徽）进行合成，引物信息见表1。qPCR反应体系为（15 μL）：2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq 7.5 μL，cDNA 1 μL，上游引物（10 μmol/L）0.3 μL，下游引物（10 μmol/L）0.3 μL，ddH₂O 5.9 μL。PCR反应在CFX96 Real-Time PCR Detection System仪器（Bio-Rad，California， USA）上进行。反应程序为（两步法）：预变性30 s（95 ℃）；变性5 s（95 ℃），退火30 s（最适退火温度），延伸30 s（72 ℃），40个循环。内参基因为GAPDH。采用2^-△△Ct方法对基因的mRNA表达水平进行相对定量分析。

1.2.4　 FOXO1干扰慢病毒重组质粒构建与病毒包装

首先，利用Thermofisher的RNAi设计在线工具（http：//rnaidesigner.thermofisher.com.rnaiexpress/）设计3条（sh-FOXO1-2286、sh-FOXO1-1807和sh-FOXO1-1798）靶向FOXO1的短发夹RNA序列（表2）。序列经通用生物（安徽）合成后，将其互补的2条链经退火形成的双链shRNA序列和pENTR/CMV-GFP/U6载体分别双酶切（BamH I和Xho I）。接着，分别将3条shRNA序列与U6质粒连接，命名为pENTR/U6-Sh-FOXO1-2286、pENTR/U6-Sh-FOXO1-1807和pENTR/U6-Sh-FOXO1-1798。进一步扩增FOXO1的CDS区，并将其与Psicheck II载体连接以构建重组质粒（psicheckII-FOXO1）。将上述所得到的4个重组质粒送至杨凌奥科生物技术有限公司进行测序。确定测序结果正确进行后续试验。将pENTR/U6-shRNA或pENTR/U6-NC分别与psicheck II-FOXO1质粒混合，形成DNA-脂质体混合物，加入HEK293T细胞（24孔板）中，于37 ℃、5% CO₂培养环境中培养。48 h后，利用双荧光素酶报告基因实验测定荧光素酶活性，鉴定出最佳干扰效率的shRNA序列，并将其包装慢病毒。最后，利用Lipofectamine^TM 3 000将重组载体c-shRNA与辅助载体pMD2G和psPAX2共转染HEK293T细胞。转染24 h后即可利用倒置显微镜观察荧光表达情况，并分别于48 和72 h收集上清液用于浓缩和纯化病毒。

1.2.5　最佳感染复数（Multiply of infection，MOI）值的确定

将F3代密度适宜的牛脂肪细胞铺至96孔板中（n=3），待细胞汇合度达50%左右时，设置多个感染梯度（MOI=30、60、90、120、150和180），利用1/2小体积感染法侵染脂肪细胞，并于4 h后补全培养基。待24 h后换为新鲜培养基。最后，于72 h时根据感染不同浓度病毒的牛脂肪细胞生长状态及其荧光表达情况确定最佳感染复数。

1.2.6　EdU染色

接种牛前体脂肪细胞至24孔板（n=3），待牛前体脂肪细胞汇合度达50%左右时，以最佳MOI的病毒量侵染脂肪细胞，并于感染第3天进行EdU染色。首先，用EdU工作液（20 μmol/L）孵育牛脂肪细胞4 h（37 ℃）；接着，用4%多聚甲醛固定细胞15 min；并在室温下用0.3% Triton X-100通透细胞15 min；经洗涤后，加入1×Hoechst 33342溶液避光染核10 min；最后，于倒置显微镜下进行荧光检测，并拍照记录。

1.2.7　细胞周期测定

感染Lv-NC和Lv-FOXO1第3天的牛脂肪细胞（n=3）经胰酶消化后收集于1.5 mL离心管中，利用预冷的PBS溶液洗细胞2次，并用预冷70%乙醇固定12 h。利用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（Beyotime）对已固定的牛脂肪细胞用碘化丙啶（Propidium iodide，PI）进行核染色，并于37 ℃避光条件下孵育30 min；最后，利用流式细胞仪（BD Biosciences， New Jersey， USA）进行检测。

1.2.8　数据分析

EdU染色结果由Image J软件（Bethesda， Maryland， USA）进行分析，EdU标记的增殖细胞数量除以Hoechst 33342标记的细胞核数量即为细胞增殖率。细胞周期结果由FlowJo_v10.6.2软件（BD Biosciences）进行分析。利用Image Pro Plus软件（MEDIA CYBERNETICS， Maryland， USA）对GFP及油红O进行量化。使用GraphPad Prism 8.0（San Diego， California， USA）进行单因素方差（one-way ANOVA）分析（或t检验分析）显著性并绘图，**表示极显著差异（P<0.01），*表示显著差异（P<0.05）。

2　结果与分析

2.1　牛脂肪细胞的分离与培养

本研究采用组织块法成功分离得到牛脂肪细胞。如图1（a）所示，分离第5天组织块周围已有少量脂肪细胞生长。随着时间的推进，脂肪细胞数量逐渐增多，初始分离的脂肪细胞活力良好，形态规则、呈长梭形（图1（b）~（c））。

2.2　牛脂肪细胞的鉴定

利用分化培养基对所分离牛脂肪细胞进行诱导分化，并采用表型鉴定（油红O染色和Bodipy染色）和标志基因表达谱鉴定2种方法共同鉴定牛脂肪细胞的纯度和分化能力。油红O染色结果显示（图2（a）），分化第8天的牛脂肪细胞中有大量脂滴聚集，脂滴呈鲜红色的球状。Bodipy染色发现（图2（b）），分化第8天的牛脂肪细胞荧光强度较强，说明其脂质含量丰富。进一步用qPCR检测成脂标志基因在牛脂肪细胞分化过程中的表达模式发现（图2（c）~（e）），相较于分化0 d，成脂标志基因PPARG和FABP4的表达量随脂肪细胞分化进程的推进极显著上调（P<0.01），于分化第4天达峰值，随后下调；CEBPB与PPARG相似，随着分化进程推进，其表达量逐渐上调，于分化第4天达高峰（P<0.01），随后下调，分化第8天后其表达量开始回升。说明此次分离的脂肪细胞纯度高，且有很强的分化潜能，可用于后续试验。

2.3　牛FOXO1干扰慢病毒载体的构建与病毒包装

将所获得的pENTR/U6-sh-FOXO1-2286、pENTR/U6-sh-FOXO1-1807、pENTR/U6-sh-FOXO1-1798和psicheck II-FOXO1 4个重组质粒进行测序发现（图3（a）），序列正确且无突变。将3个pENTR/U6-shRNA分别与psicheck II-FOXO1混合，并转染至HEK293T细胞中。双荧光素酶活性报告试验显示（图3（b）），与对照组pENTR/U6-NC相比，pENTR/U6-sh-FOXO1-2286、pENTR/U6-sh-FOXO1-1807和pENTR/U6-sh-FOXO1-1798的相对酶活均极显著下调（P<0.01）。最后，选择干扰效果最好的pENTR/U6-sh-FOXO1-2286序列进行单靶点慢病毒（记为Lv-FOXO1）包装，Lv-FOXO1和Lv-NC的滴度分别为3×10⁸ U/mL和1.5×10⁸ U/mL。

2.4　最佳MOI值的摸索与干扰效率检测

为确定所包装Lv-FOXO1在脂肪细胞中的最佳MOI，本研究设置了6个MOI梯度（MOI分别为30、60、90、120、150和180）感染牛脂肪细胞。结果发现（图4（a）~（b）），MOI为90时，牛脂肪细胞荧光数最高且细胞状态良好，说明其感染效率最佳。以最佳MOI值（MOI=90）的病毒添加量感染脂肪细胞，发现FOXO1的表达量极显著下调（P<0.01），干扰效率为42%左右（图4（c））。说明所包装的Lv-FOXO1效果较好，可用于后续试验。

2.5　干扰FOXO1促进牛脂肪细胞的增殖

本研究利用EdU染色从表型上观察了FOXO1对牛脂肪细胞增殖的影响，发现Lv-FOXO1组中增殖的牛脂肪细胞数量明显多于Lv-NC组（图5（a））。进一步用Image J软件量化2组EdU染色的结果发现，干扰FOXO1极显著提高了牛脂肪细胞的增殖率（P<0.01；图5（b））。这一结果说明干扰FOXO1可促进牛脂肪细胞的增殖。

2.6　干扰FOXO1促进牛脂肪细胞G1/S期的转化

真核细胞周期可分为4阶段：G1期（细胞变大，评估其代谢状态并准备分裂）、S期（实际基因组复制发生的地方）、G2期（细胞检查DNA复制的完成并准备分裂）和M期（发生有丝分裂和细胞分裂）。本研究用流式细胞术检测干扰FOXO1对牛脂肪细胞增殖周期的影响发现（图6（a）~（c）），干扰FOXO1减少了牛脂肪细胞G1期阳性细胞的比例，增加了S期阳性细胞的比例，促进了牛脂肪细胞G1/S期的转化，进而缩短了G1/S期的时间，促进了牛脂肪细胞增殖。

2.7　干扰FOXO1促进牛脂肪细胞增殖标志基因的表达

为探究FOXO1对牛脂肪细胞增殖标志基因表达的影响，在牛脂肪细胞中分别感染Lv-NC和Lv-FOXO1，提取其RNA，由图7（a）可知，本研究所提取的RNA可清晰看见28S和18S 2条带，表明RNA质量较好，可用于后续试验。将检验合格的RNA逆转录，并用于检测感染Lv-FOXO1后牛脂肪细胞中增殖标志基因表达的变化。结果显示（图7（b）），干扰FOXO1极显著上调了增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达（P<0.01）。此结果说明，干扰FOXO1可通过促进增殖标志基因的表达促进牛脂肪细胞的增殖。

2.8　干扰FOXO1抑制牛脂肪细胞脂滴的生成

本研究将Lv-NC和Lv-FOXO1分别感染至牛脂肪细胞中，诱导细胞分化至第4天进行油红O染色。结果发现（图8（a）~（b）），相较于Lv-NC组，Lv-FOXO1组生成脂滴明显减少。进一步利用Image Pro Plus软件量化油红O染色结果发现（图8（c）），干扰FOXO1极显著减少了牛脂肪细胞脂滴的生成（P<0.01）。

2.9　干扰FOXO1抑制牛脂肪细胞分化标志基因的表达

为明晰FOXO1对牛脂肪细胞分化的调控作用，本研究进一步探究了干扰FOXO1对牛脂肪细胞中成脂标志基因表达的影响。RNA质检结果显示（图9（a）），本探究所提取RNA质量较好，可满足后续试验要求。进一步利用qPCR方法检测了Lv-FOXO1的干扰效率和成脂标志基因PPARG、CEBPB和LPL的表达变化。结果显示（图9（b）），感染Lv-FOXO1的牛脂肪细胞中FOXO1的表达量于分化第4天极显著下调，可用于后续试验。此外，本研究发现（图9（c）），干扰FOXO1极显著降低了成脂标志基因PPARG的表达（P<0.01），并显著抑制了CEBPB和LPL的表达（P<0.05）。此结果说明，干扰FOXO1可通过抑制牛脂肪细胞成脂标志基因的表达抑制其分化。

3　讨论

3.1　 FOXO1在牛脂肪生成中的重要作用

脂肪组织是机体储存能量、维持稳态的重要组织之一，其在动物体中的含量在一定程度上影响并决定着肉的嫩度、多汁性和风味的好坏^［13］。再者，脂肪的生成是一个复杂但协调的生物学过程，其主要经历了MSCs分化形成前体脂肪细胞和前体脂肪细胞终末分化形成成熟的脂肪细胞2个过程^［14］。因此，探究调控脂肪细胞增殖和分化的作用机制对牛肉质的改良有重要作用。研究表明，脂肪的生成受到许多内部因子的调控和外部信号的参与，这一系列有序的反应互相协作和影响，组成了一个复杂而精密的调控网络，推动着脂肪生成的进程^［3］。目前，以PPARG和C/EBP家族成员为中心调控脂肪生成的分子网络不断完善^［3］，但涉及脂肪生成的许多途径和潜在靶点尚未发现或其作用机制尚不明晰。

FOXO1因其在脂肪细胞分化和脂质代谢中所发挥的重要调控作用而成为脂肪生成和沉积的关键转录因子之一^［15］。作为FoxO亚家族成员之一，FOXO1参与调控细胞周期、脂肪细胞分化和脂质代谢等过程^［16-17］。目前，有关FOXO1对细胞增殖作用的研究主要集中在癌细胞中^［18-19］，FOXO1对脂肪细胞增殖的作用机制仍不明晰。Chae等^［20］报道，G9a介导的FOXO1甲基化可通过降解FOXO1促进结肠癌细胞的增殖，并减少细胞凋亡。再者，FOXO1还被证明在包括胃肠间质瘤^［21］和肾癌^［22］在内的几种细胞系中显著抑制细胞增殖并增加细胞凋亡。另一方面，与FOXO1基因对脂肪细胞分化的作用相关研究在人和小鼠等动物中略有涉及，如Liu等^［23］发现沉默FOXO1会抑制小鼠脂肪细胞分化和脂滴生长，但Dong等^［24］报道，在脂肪生成的早期，FOXO1可通过抑制PPARG的转录来阻碍猪前脂肪细胞的分化，这2种结论无疑是相悖的。近些年，有关牛FOXO1基因的研究逐渐增多，如对牛FOXO1基因的组织表达分析以及肉质性状关联分析等^［25-26］。课题组前期研究发现^［27］，FOXO1在牛脂肪细胞分化过程中差异表达，推测其在牛脂肪生成中发挥着重要作用，但FOXO1基因对牛脂肪生成的作用机制尚不明晰。因此，深入研究FOXO1基因在牛脂肪细胞增殖和分化过程中的调控作用对改善肉牛肉质性状具有重要意义。

3.2　 FOXO1对牛脂肪细胞增殖的影响

细胞增殖主要分为S期（合成期）和M期（有丝分裂期），在S期和M期之前有2个中间间隙期：G1期和G2期^［28-29］。在分子水平上，越来越多的证据表明，真核生物中的细胞周期进程是由进化上保守的中枢机制驱动的，该机制主要包括CDK，其可通过磷酸化增殖关键靶标促进DNA合成和染色体分裂^［30］。CDK的活性是通过与细胞周期蛋白结合来调节，细胞周期蛋白的水平则会根据细胞周期的特定阶段而波动^［30-31］。具体而言，CDK与Cyclin一起共同调控细胞周期，CCNB与CDK1结合，CDK1在G1之前的M期被激活，CDK2在G1/S转化时与CCNE结合，在S期时与CCNA结合^［30-32］。此外，PCNA是复制过程中DNA聚合酶必不可少的辅助因子，且其可将聚合酶与DNA结合并显著增加其合成能力^［33］。目前，有关FOXO1对脂肪细胞增殖的调控作用在小鼠和猪中已有相关报道。如Nakae等^［34］研究表明，FOXO1可通过激活其靶标细胞周期抑制剂p21以及抑制增殖标志基因CCND1和CCND2的表达影响脂肪生成。本研究发现，干扰FOXO1显著增加了S期牛脂肪细胞阳性细胞数量，其可通过缩短G1/S期转化的时间促进牛脂肪细胞增殖。再者，qPCR发现，干扰FOXO1极显著促进了增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达（P<0.01）。因此，本研究发现干扰FOXO1可通过促进PCNA、CDK1和CDK2等增殖标志基因的表达调控牛脂肪细胞G1/S期的转化，进而正向调控牛脂肪细胞的增殖。

3.3　 FOXO1对牛脂肪细胞分化的影响

据报道，FOXO1可通过PI3K/AKT和ERK/MAPK通路间接调控脂肪细胞分化^［7-8］。早在2003年， FOXO1就被证明在激素激活的信号通路与促进脂肪细胞分化的复杂转录级联的整合中起重要作用^［34］。但目前，FOXO1在调控脂肪细胞分化的作用还不明晰，甚至在一些结论上相互矛盾。成脂标志基因PPARG和C/EBP在脂肪细胞生成过程中相互作用、相互调控，共同调控着生脂基因的表达和胰岛素的敏感性，推动着脂肪生成的进程^［3］。具体而言，CEBPB和C/EBPδ在早期激活PPARG表达中起重要作用，激活的PPARG诱导CEBPA和其他生脂基因的表达以促进终末分化，之后CEBPA又通过正反馈回路维持PPARG的表达^［35-36］。另一方面，LPL是将三酰基甘油积累到脂肪细胞中的限速酶，可促进脂质的摄取和储存^［37-38］。因LPL在脂肪细胞生成早期就开始表达，且在分化的细胞中持续表达而被作为脂肪细胞分化的早期标记物之一^［37］。本研究探究了干扰FOXO1对PPARG、CEBPB和LPL表达的影响，结果发现干扰FOXO1极显著下调了PPARG的表达，并显著下调了CEBPB和LPL的表达。这一结果与Munekata等^［7］的报道一致，干扰FOXO1可通过抑制PPARG和CEBPA的表达抑制脂肪细胞分化，其抑制机制可能是干扰FOXO1抑制了IRS2的表达所致。再者，利用FOXO1抑制剂AS1842856处理小鼠的3T3-LI细胞发现，AS1842856可通过抑制PPARG蛋白的表达抑制脂肪细胞分化和脂滴的生成^［23］。

基于此，本研究发现干扰FOXO1可减少牛脂肪细胞的脂滴生成，这一作用是通过下调成脂标志基因PPARG、CEBPB和LPL的表达来实现的。此外，FOXO1调控牛脂肪生成的潜在分子机制仍需进一步探究，该结果亦需在活体水平上进行验证。

4　结论

干扰FOXO1可通过上调增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达促进牛脂肪细胞增殖，且其可通过降低成脂标志基因PPARG、CEBPB和LPL的表达减少牛脂肪细胞脂滴形成，抑制牛脂肪细胞的分化，进而影响脂肪的沉积。本研究为分析FOXO1基因调控脂质沉积和改善牛肉品质的转录调控提供依据。

参考文献

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基金资助

国家自然科学基金项目(32060744)

国家自然科学基金项目(32202641)

宁夏自然科学基金项目(2023AAC03394)

宁夏重点研发计划项目(2023BCF01006)