非洲马瘟病毒VP7蛋白ELISA阳性血清标准样品的初步制备

Preliminary preparation of African horse sickness virus VP7 protein ELISA positive serum standard

摘要

为制备非洲马瘟病毒VP7蛋白ELISA阳性血清标准样品，筛选一匹无常见马属动物疫病抗体的马作为靶动物，利用大肠杆菌原核表达系统制备的VP7蛋白为免疫原，将免疫原与MONTANIDE ISA35佐剂等体积混合乳化后，每两周免疫1次，共进行3次免疫，每周采集血清，检测其血清抗体ELISA效价。在血清效价高时大量采血分离血清，验证其无菌性，并将高效价血清进行冻干，参照《中华人民共和国兽药典》中的方法对该血清进行特异性检验、无菌检验、均一性评估和稳定性评估。结果表明：1）在免疫后第3周，可以检测到免疫马体内的非洲马瘟抗体。2）特异性结果显示马流感病毒、马疱疹病毒Ⅰ型、马疱疹病毒Ⅱ型、马疱疹病毒Ⅳ型、马动脉炎病毒、马传染性贫血病毒、马链球菌、马流产沙门菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、马驽巴贝斯虫和马泰勒虫抗体检测结果均为阴性。说明制备的标准血清背景干净，无常见马属动物疫病抗体。3）无菌检验结果显示酪胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基和硫乙醇酸盐液体培养基上均无杂菌生长，说明制备的血清中无细菌和真菌等微生物污染。4）稳定性评估结果显示制备的血清在4、25和37 ℃环境下可稳定保存2个月，在-20和-80 ℃环境下可稳定保存6个月。综上，本研究成功制备了非洲马瘟病毒VP7蛋白ELISA阳性血清标准样品，该标准样品的制备为非洲马瘟的相关研究奠定理论基础。

Abstract

The study aimed to prepare a positive serum standard of VP7 protein for the ELISA of the African horse sickness virus， a horse without antibodies against common equine diseases was selected as the target animal， and VP7 protein expressed by the prokaryotic expression system of Escherichia coli was used as the immunogen. The immunogen was mixed with MONTANIDE ISA35 adjuvant in equal volume and emulsified， and then the horse was immunized once every 2 weeks for a total of 3 immunizations， and serum was collected to detect the serum antibody titer by ELISA. When the serum potency was highest， a large amount of blood was collected to isolate the serum and verify its sterility， and the high valence serum was lyophilized.The specificity， sterility， uniformity and stability of the serum were tested according to the methods in the Veterinary Pharmacopoeia of the People's Republic of China. The results showed that： 1） Antibodies against African horse sickness could be detected in the immunized horse in the third week after immunization. 2） The specificity results showed that antibodies against equine influenza virus， equine herpesvirus type I， equine herpesvirus type II， equine herpesvirus type IV， equine arteritis virus， equine infectious anemia virus， equine streptococcus， equine Salmonella abortus， Burkholderia pseudomallei， Babesia caballi and Theileria equi were all negative. The prepared standard serum had a clean background and no common equine pathogenic antibodies. 3）There was no growth of stray organisms on the case peptone agar medium， tryptic soy peptone liquid medium and thioglycolate liquid medium， indicating that the prepared serum was free from microbial contamination such as bacteria and fungi. 4）The stability test results showed that the prepared serum can be stably stored for 2 months at 4， 25 and 37 ℃ and for 6 months at -20 and -80 ℃ .In conclusion， this study successfully prepared positive serum standard of VP7 protein for the ELISA of the African horse sickness virus， which laid a theoretical foundation for related research on African horse sickness.

Graphical abstract

关键词

非洲马瘟 / 阳性血清 / ELISA / 标准样品

Key words

African horse sickness / positive serum / ELISA / standard samples

非洲马瘟（African horse sickness，AHS）是由非洲马瘟病毒（African horse sickness virus，AHSV）引起的一种急性或亚急性的虫媒传染病，通过库蠓等吸血昆虫传播^［1］，可感染所有的马属动物，致死率高达95%^［2］，被WOAH（World Organisation for Animal Health，WOAH）列为A类动物疫病，一经发现需上报扑杀^［3］。非洲马瘟主要分布在非洲撒哈拉沙漠以南地区，偶尔也在非洲北部、中东和欧洲发生，呈季节性流行，在温热，潮湿季节多发。2020年，首次在东南亚国家（泰国和马来西亚）发现非洲马瘟疫情^［4-5］，此次非洲马瘟疫情，累积死亡马超200匹，对当地马属动物产业造成严重经济损失，而目前非洲马瘟在亚洲的流行情况尚不清楚。我国从未发生过非洲马瘟，被WOAH认定为无疫国，但云南省临近泰国，其温暖潮湿的环境以及大量的库蠓为AHS在我国暴发提供了条件^［5］。

非洲马瘟病毒属于呼肠孤病毒科环状病毒属^［6］，病毒表面无囊膜^［7］，RNA基因组被包裹在病毒核心颗粒内，核心颗粒由2个主要蛋白VP3和VP7，以及3个次要蛋白VP1、VP4和VP6构成^［8］。其中VP7是内衣壳蛋白，有较好的免疫原特性，文献报道的非洲马瘟血清学检测方法大部分基于此蛋白^［9-10］。

目前，非洲马瘟抗体检测方法ELISA常被用于大规模血清学初筛，当前商品化非洲马瘟ELISA试剂盒仍依赖进口，而进口试剂盒价格昂贵，货期较长，亟须建立准确，便捷的ELISA检测方法，研发出国产的非洲马瘟商品化试剂盒。而阳性血清在抗体检测方法中至关重要，但我国目前尚无标准化、商品化的非洲马瘟阳性血清供应。本研究采用纯化的VP7蛋白免疫马匹制备AHSV阳性血清，并对其进行质量检验，制备了一批标准阳性血清用以标定AHSV ELISA检测方法，解决国内AHSV血清学诊断无标准阳性血清的实际问题。

1　材料与方法

1.1　材料

非洲马瘟抗体阴性马，马流感抗体检测试剂盒和马链球菌抗体检测试剂盒为法国ID.Vet公司产品，非洲马瘟病毒cELISA抗体检测试剂盒、马动脉炎病毒ELISA抗体检测试剂盒为西班牙英吉纳公司产品，马流产沙门氏菌抗体检测试剂盒、马传染性贫血抗体检测试剂盒为国生生物公司产品，马驽巴贝斯虫抗体检测试剂盒和马泰勒虫抗体检测试剂盒为美国VMRD公司产品，支原体检测试剂盒为碧云天公司产品，酪胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基为hopebio公司产品，硫乙醇酸盐液体培养基为oxoid公司产品，MONTANIDE ISA35佐剂为法国赛比克公司产品，纯化的VP7蛋白为本实验室前期制备保存。

1.2　免疫采血

用商品化试剂盒和实验室建立方法对免疫靶动物进行筛选，共计从23匹马中筛选出一匹马流感、马腺疫、马疱疹病毒Ⅰ型感染、马疱疹病毒Ⅱ型感染、马疱疹病毒Ⅳ型感染、马流产沙门菌病、马驽巴贝斯虫病、马泰勒虫病、马病毒性动脉炎、马传染性贫血和马鼻疽11种常见马属动物疫病抗体阴性马，用MONTANIDE ISA35佐剂乳化VP7蛋白，蛋白浓度为2 mg/mL，V_佐剂∶V_蛋白=1∶1，随后用乳化后VP7蛋白进行免疫，免疫方案如表1。

首免后，每周均进行无菌采血，3 000 r/min离心30 min，分离血清，并监测免疫后血清抗体效价变化，选择稀释8倍后ELISA检测依旧为阳性的血清制备标准阳性血清，放置于-20 ℃冷冻保存备用。

1.3　阳性血清的检验

1.3.1　特异性检验

按照《中华人民共和国兽药典》中的方法检测阳性血清中是否存在细菌、真菌、支原体和外源病毒抗体^［11］。

1.3.2　效价检测

用英吉纳非洲马瘟病毒cELISA抗体检测试剂盒检测1.2中的血清抗体效价。选择高效价的血清作为阳性血清。

1.4　阳性血清冻干

在制备的血清中加入冻干稳定剂并混匀，按照0.5 mL/支进行分装，真空冷冻干燥。将冻干血清作为非洲马瘟病毒VP7蛋白ELISA阳性血清标准样品。

1.5　冻干血清检验

1.5.1　物理性状

随机抽取3支冻干阳性血清样品，观察颜色和性状，再打开安瓿瓶加入PBS溶解，记录溶解情况。

1.5.2　无菌检验

随机抽取3支冻干阳性血清样品，按文献方法^［11］进行。

1.5.3　冻干前后血清效价检验

随机抽取冻干前后各3支阳性血清，用英吉纳非洲马瘟病毒cELISA抗体检测试剂盒检测其效价，并进行效价比较。

1.5.4　冻干血清均一性评估

随机抽取规定数量的样品，按文献方法^［11］进行。

1.5.5　冻干血清稳定性评估

随机抽取规定数量的样品分别放置于4、25和37 ℃，在第1、2、3、4、8周检测其效价并记录，以验证其运输稳定性。随机抽取规定数量的样品分别放-20 和-80 ℃冰箱，在1、2、3、4、5和6个月检测其效价并记录验证其运输稳定性，以验证其长期稳定性（表2）。

2　结果与分析

2.1　阳性血清的制备

如表3所示，经多种检测方法筛选到一匹无多种常见马属动物疾病抗体的马，按免疫程序免疫后试验马均未出现局部和全身不适。如图1所示，血清中非洲马瘟ELISA效价随着免疫次数的增加呈递增的趋势，3次免疫后（第6周）效价可达到1 024，此后的一周（第7周）效价下降到512，并维持到第10周，在第7周时大量采集马血，制备冻干阳性血清。经多种方法验证制备的阳性血清中常见马属疫病抗体均为阴性（表3）。

2.2　物理性状

随机抽取冻干血清3支，观察其物理性状为淡黄色团块，易与瓶壁脱离。打开安瓿瓶加入0.5 mL PBS，静置10 min，溶解后血清呈淡黄色透亮液体。此结果表明冻干阳性血清的物理性状为淡黄色团块状，能溶解于PBS溶液。

2.3　无菌检验

随机抽取3支冻干阳性血清分别命名为S1、S2和S3进行检测，在培养基上均无细菌或真菌生长，此结果表明冻干阳性血清无菌检验结果符合规定。

2.4　冻干前后效价检验

为检验冻干技术对标准物质效价是否有影响，并确定冻干后第0天效价，选取冻干前3支血清命名为B1~B3、冻干第0天阳性血清3瓶分别命名为A1~A3，用英吉纳非洲马瘟病毒cELISA抗体检测试剂盒进行检测，步骤按照试剂盒说明书进行。此结果如表4所示，这表明冻干前后血清效价并未发生明显变化，均为256。

2.5　均一性评估

随机抽取10支冻干血清，依次命名为U1、U2、U3、U4……U10，用英吉纳非洲马瘟病毒cELISA抗体检测试剂盒进行检测，每份样品重复测试2次，检测BP值结果见表5。采用单因子方差分析法对检测结果进行均一性评估，根据单因子方差分析，统计量F=样品间平方和/样品内平方和。当F小于F_0.05的临界值（3.02）时，即认为样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。检验结果如表6所示，F<3.02，这表明冻干阳性血清均一性较好。

2.6　稳定性评估

随机抽取45支冻干阳性血清用于运输稳定性评估，将其放置于4、25及37 ℃，储存1、2、3、4和8周；随机抽取36支冻干阳性血清用于长期稳定性评估，将其放置于-20 和-80 ℃冰箱，放置1、2、3、4、5和6个月。储存到期后，将冻干阳性血清取出，使用英吉纳非洲马瘟病毒cELISA抗体检测试剂盒检测血清效价，检测2次取平均值，如表7所示，在不同温度下放置8周，效价稳定在256；在-20 和-80 ℃温度下放置6个月，效价仍为256，该结果表明冻干阳性血清的运输稳定性及长期稳定性较好。

3　讨论

当前用于诊断非洲马瘟的方法主要有病原学和血清学两大类。我国是非洲马瘟无疫国，无非洲马瘟病原，病原学检测方法并不适用于疫情的监测。在血清学方法中，ELISA适用于大规模血清学初筛，而在ELISA方法研发中，标准阳性血清作为诊断的阳性标准，对整个方法的建立至关重要。

在ELISA中，阳性对照血清和阴性对照血清的质量直接关系到诊断结果的准确性，因此制备ELISA阳性血清标准样品对于血清国家参考品的标定及阳性对照血清的生产均具有十分重要的意义。当前已有多个研究机构开展动物病原阳性血清的制备研究，如高金源等^［12］采用常见猪病毒抗体阴性仔猪制备了猪轮状病毒G5型阳性血清，可用于猪轮状病毒活疫苗或其联苗检验；王秀丽等^［13］制备了沙门菌马流产凝集试验阳性血清国家参考品，对于抗原国家参考品、血清国家参考品的标定以及诊断抗原和对照血清的生产均具有十分重要的意义；李晶梅等^［14］用鸡制备猪丁型冠状病毒（PDCoV）阳性血清，制备的阳性血清可用于IFA检测PDCoV，且不与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒等病原反应，特异性良好。

本研究按照WOAH研究标准、中国兽药典和国家计量技术规范制备了非洲马瘟病毒VP7蛋白ELISA阳性血清标准样品。为保证产品质量，本研究采取了以下措施：一是免疫原的选择，S7基因在AHSV 9个型中高度保守^［15］，本研究选取了AHSV S7基因作为靶基因，进而用该基因编码的VP7蛋白免疫马制备了阳性血清，其可用于9个型的诊断；二是对免疫靶动物进行了筛选，选择一匹没有常见马属动物疫病抗体的马进行免疫，保证了制备的AHSV阳性血清的纯净性；三是对冻干血清进行了均一性评估，保证了冻干血清的均一性；四是对冻干血清进行了稳定性评估，提供了其保存期的监测数据。标准样品在4、25和37 ℃的加速老化试验中显示出良好的稳定性，保质期试验结果显示，本研究制备的标准样品可在-20及-80 ℃条件下稳定保存6个月，可广泛应用于实验室的ELISA检测中，以满足我国非洲马瘟病毒ELISA方法建立及检测需求。

4　结论

本研究用非洲马瘟VP7重组蛋白与MONTANIDE ISA35佐剂混合后免疫马后获得非洲马瘟病毒VP7蛋白ELISA阳性血清，对阳性血清进行冻干以及冻干后检验，成功制备出ELISA效价为 256，无菌检验、均一性评估及稳定性评估均合格的非洲马瘟病毒 VP7蛋白ELISA阳性血清标准样品。本研究将有助于非洲马瘟血清学检测方法的建立，为进一步研究非洲马瘟诊断技术及试剂盒研发奠定理论基础。

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基金资助

十四五国家重点研发计划(2021YFD1800500)