丝羽乌骨鸡SLC38A11基因分型及其与皮肤乌色度关联分析

Genotyping of SLC38A11 gene in Silky fowls and its association with skin blackness

摘要

为进一步验证SLC38A11在丝羽乌骨鸡黑色素沉积中的作用，本研究采用基于飞行时间质谱分析技术对SLC38A11基因SNPs位点进行基因分型，对所有SNP位点利用Hapoview4.1进行连锁不平衡分析，并检测SNP位点是否处于H-W平衡状态，分析基因型与皮肤亮度L*值关联性，筛选对皮肤乌色度显著相关的SNP标记。结果表明：1）SLC38A11基因4个多态性位点质谱检出率为100%，每个位点都有3种基因型。SLC38A11基因SNP1位点为错义突变，SNP2、SNP3和 SNP4 3个SNPs位点均为同义突变。2）卡方检验表明，SNP1位点偏离H-W平衡（P<0.05），其他3个SNPs位点均处于H-W平衡状态（P>0.05）。SNP1位点遗传多样性较低，其他3个SNPs位点为中度多态。3）单标记关联分析表明，SNP1位点TC基因型的胸部皮肤亮度L*值显著低于CC和TT基因型（P<0.05）；SNP2位点AA基因型的胸部皮肤亮度L*值显著低于GG与GA基因型（P<0.05）；SNP3位点TT基因型的胸部皮肤亮度L*值显著低于CC与CT基因型（P<0.05）。4）SNP2、SNP3和SNP4之间的强连锁产生了3种单倍型，H3H3单倍型（AATTAA基因型）胸部皮肤亮度L*值显著低于单倍型H2H3（GACTAG）和H2H1（GGCCAA）。SNP1～SNP4 4个位点基因型合并后，TCAATTAA胸部皮肤亮度L*值显著低于CCGGCCAA、TTGACTAG和CCGACTAG。综上，SLC38A11基因与丝羽乌骨鸡胸部皮肤乌色度密切相关，TCAATTAA基因型可作为研究丝羽乌骨鸡胸部皮肤乌色度的候选分子标记，为下一步利用分子标记辅助育种加快培育乌色度高的丝羽乌骨鸡新品种提供参考。

Abstract

To further verify the role of SLC38A11 in melanin deposition in black bone chickens， this study genotyped the SNPs loci of the SLC38A11 gene based on time-of-flight mass spectrometry analysis technology. Hapoview 4.1 was used to analyze the linkage disequilibrium of all SNP sites， and detected whether the SNP sites were in an H-W equilibrium state， and analyzed the correlation between genotype and skin brightness L* value， and screened SNP markers that were significantly correlated with skin blackness. The results were as follows：1）The mass spectrometry detection rate of four polymorphic loci in the SLC38A11 gene was 100%， and each locus had three genotypes. The SNP1 of SLC38A11 gene was a missense mutation， the SNP2， SNP3 and SNP4 were all synonymous mutations. 2）Chi-squared test showed that SNP1 deviated from Hardy-Weinberg equilibrium balance（P<0.05） and the other three SNPs were in Hardy-Weinberg equilibrium balance（P>0.05）. The genetic diversity of SNP1 locus was lower， and the other three SNPs loci were moderately polymorphic. 3）Single marker association analysis showed that the breast skin brightness L* value of the TC genotype at the SNP1 locus was significantly lower than that of the CC and TT genotypes（P<0.05）. The breast skin brightness L* value of the AA genotype at the SNP2 locus was significantly lower than that of the GG and GA genotypes （P<0.05）. The breast skin brightness L* value of the TT genotype at the SNP3 locus was significantly lower than that of the CC and CT genotypes（P<0.05）. 4）The Linkage disequilibrium analysis of four SNPs showed that the strong linkage among SNP2， SNP3 and SNP4 produced three Haplotypes. Association analysis found that the breast skin color brightness L* value of H3H3 Haplotype （AATTAA genotype） was significantly lower than that of Haplotype H2H3（GACTAG）and H2H1 （GGCCAA）. After the combination of SNP1-SNP4 genotypes， the breast skin color brightness L* value of TCAATTAA was significantly lower than that of CCGGCCAA， TTGACTAG and CCGACTAG. the TCAATTAA genotype had a lower L* value for breast skin brightness and a higher blackness. In summary， the SLC38A11 gene is closely related to the breast skin blackness， and the TCAATTAA genotype can be used as a candidate molecular marker for studying the breast skin blackness in Silky fowls. It will provide a theoretical reference for using molecular marker assisted breeding to accelerate the cultivation of new Silky fowls with higher blackness.

Graphical abstract

关键词

乌骨鸡 / SLC38A11 / 乌色度 / SNP位点 / 连锁不平衡

Key words

black-bone chickens / SLC38A11 / blackness / SNP sites / linkage disequilibrium

丝羽乌骨鸡具有药用和食用价值，具有乌皮、乌肉等特点，深受广大消费者的喜爱^［1-2］。黑色素沉积是造成乌色形成的主要原因^［3-4］，人们在消费中惯于以其乌色度的深浅来评判品质的优劣^［5-6］。在丝羽乌骨鸡的研究和开发利用过程中，“乌肤、乌肉、乌骨”为主要研究目标，其中“乌肤”是丝羽乌骨鸡最显著的特点^［7］。在育种过程中通常以肉眼观察皮肤乌色度进行选育，世代遗传进展缓慢，利用分子标记辅助选育十分必要。寻找影响丝羽乌骨鸡黑色素沉积的主效基因或分子标记物，并在生产中利用分子标记物对乌色度进行早期选择，对于提高皮肤乌色度世代选育进展具有重要意义。黑色素沉积是一个复杂的调控系统，经历成黑色素细胞的分化及迁移、黑色素的合成及转运等过程，受到多种基因和信号通路等因子调控^［8-9］。溶质载体（Solute carrier family，SLC）家族是一类重要的跨膜蛋白，负责神经递质、氨基酸等多种物质的跨膜运输和吸收^［10］。SLC共有395个成员，分为52个家族，其中氨基酸转运蛋白家族SLC38由11个成员组成，称为SLC38A1-SLC38A11，它们介导NaC依赖性氨基酸净摄取和流出的转运，在神经元或星形胶质细胞之间的谷氨酸/谷氨酰胺循环中发挥重要作用^［11-12］。Chan等^［13］研究了SLC38A3的重要性及其运输谷氨酰胺的能力，并被证明在小鼠氨基酸代谢中具有关键作用。另外，SLC38A6、Slc38A8等家族成员等在代谢、稳态和神经传递中发挥不同作用^［14-16］。SLC38A11仍然是SLC38家族的孤儿成员，其功能尚未得到深入研究，Aggarwal等^［17］研究发现SLC38A11主要在果蝇唾液腺和大脑中表达。SLC的一些其他家族成员SLC24A5 基因SNP（G482C）位点与他留乌骨鸡肤色显著相关^［18-19］。SLC7A11、SLC25A4和SLC17A8对兔毛和乌骨绵羊乌色度产生重要影响^［20-21］，但SLC38A11基因是否对丝羽乌骨鸡肤色也有影响，值得探究。

课题组前期通过对丝羽乌骨鸡和非乌骨鸡转录组测序发现，SLC38A11在丝羽乌骨鸡皮肤和肌肉中高度表达，推测SLC38A11基因可能是影响丝羽乌色度的重要候选基因。为进一步验证SLC38A11在丝羽乌骨鸡黑色素沉积中的作用，本研究采用基于飞行时间质谱分析技术的MassARRAY平台对SLC38A11基因多个SNPs位点进行基因分型，旨在分析多态位点与皮肤乌色度的关联性，筛选对皮肤乌色度有显著效应的SNP标记，为培育乌色度更高的丝羽乌骨鸡品种提供科学理论参考依据。

1　材料与方法

1.1　试验时间与地点

2022年7—2023年11月在泰和凤升农牧科技有限公司饲养丝羽乌骨鸡，翅静脉采血，活体测定背部皮肤L*值、大腿部皮肤L*值和胸部L*值。2023年3月由江苏省家禽科学研究所家禽遗传育种重点实验室科研人员开展丝羽乌骨鸡DNA提取，2023年4月委托北京康普森农业科技有限公司开展丝羽乌骨鸡黑色素相关基因MassARRY质谱基因分型。

1.2　试验动物及样品采集

丝羽乌骨鸡来自泰和凤升农牧科技有限公司，从800只丝羽乌骨鸡群，随机选母鸡192只，记录脚号，并进行翅下静脉采血1 mL，ACD抗凝，混匀后放入-20 ℃保存备用。

1.3　皮肤亮度L*值的测定

背部皮肤亮度L*值、大腿部皮肤亮度L*值和胸部皮肤亮度L*值测定方法：将活鸡背部、大腿部和胸部3个部位的羽毛拔掉1 cm²左右的片区，用75%酒精棉球擦拭一下，再用TC-PIIG 型全自动测色色差计测定背部皮肤、大腿部皮肤和翅根下的胸部皮肤亮度L*值。所有皮肤测定均由同一人测量，所测部位基本一致。

1.4　引物设计

根据SLC38A11基因SNP位点的物理位置，基于红色原鸡参考基因组序列（Galgal5）和SNP位点序列信息，使用Sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1，设计PCR反应和单碱基扩展引物，并由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。4个具有多态性的SNPs位点质谱分型引物相关信息见表1。

1.5　PCR扩增、SAP消化、单碱基延伸

1.5.1　PCR扩增

采用苯酚-氯仿法提取全血基因组DNA，提取的DNA溶于超纯水中。针对SNP位点的DNA片段进行引物设计，扩增获得PCR 产物。384孔PCR板的PCR反应体系：dNTP mix（2 mmol/L）53 μL，MgCl₂（25 mmol/L）172.25 μL，1×PCR反应缓冲液5 μL，引物mix（0.5 μmol/L）530 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）106 μL，超纯水927.5 μL，上述试剂混合后加入384孔PCR板，4 μL混合物/孔，DNA（10 ng/μL）1μL/孔。

PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共45个循环；72 ℃延伸3 min。PCR扩增目的片段用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.5.2　SAP消化

利用虾碱性磷酸酶（SAP） 处理PCR产物去除dNTP。384孔PCR板SAP消化反应体系：超纯水810.9 μL，10倍SAP buffer 90.1 μL，SAP（1.7 U/μL）159 μL，合计1 060 μL。SAP消化程序：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.5.3　单碱基延伸反应

单碱基延伸反应体系：超纯水400.2 μL，10× buffer 106 μL，终止液106 μL，引物混合物426.1 μL，酶21.7 μL，上述试剂混合后，加入384孔PCR板，2 μL/孔。单碱基延伸反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，52 ℃退火 5 s，80 ℃延伸5 s，退火延伸5个循环，变性退火延伸共40个循环；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。PCR扩增、SAP消化、单碱基延伸相关试剂都是由Agena公司提供。

1.6　SNP位点基因分型和遗传多态性分析

稀释、点样，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS） 检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异， 确定该点处碱基，从而确定SNP基因型。

上机检测：将反应产物（共9 μL）稀释3倍，使用树脂进行脱盐；将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；基于飞行时间质谱MassARRAY平台上机进行质谱检测，并收集数据，进行SNP位点基因分型。

利用PopGene（version 1.31）统计各个SNP位点基因型频率、基因频率、杂合度（He）和多态信息含量（PIC）。对所有SNP位点利用Hapoview4.1进行连锁不平衡分析，利用卡方检验（χ²）检测SNP位点是否处H-W平衡状态。

1.7　基因型与皮肤亮度L*值相关性分析

以SPSS 16.0软件中的一般线性模型中的单变量方差分析进行基因型与皮肤亮度L*值关联分析，结果用平均值±标准差表示。固定因子：SNP标记的不同基因型，因变量：皮肤亮度L*值，采用LSD法多重比较不同标记基因型之间的皮肤亮度L^*值的差异显著性，P<0.05表示差异显著。

2　结果与分析

2.1　 SNP位点的质谱分析

SLC38A11基因SNP位点的相应位置通过“http：//asia.ensembl.org/index.html？redirect=no”查找（SNP1 染色体7：19643427，SNP2 染色体7：19642671，SNP3染色体7：19645928，SNP4染色体7：19633704）。4个SNPs位点不同基因型的质谱分析图（图1）。4个位点检出率为100%，每个位点都有3种基因型。SLC38A11基因第11外显子的突变位点（SNP1）C>T为错义突变，其他位点均为同义突变。

2.2　 SLC38A11 SNP位点的遗传多态性分析

由表2可知，每个SNP位点不同基因型频率不同。经H-W平衡检测， SNP1（第11外显子rs740324212）偏离H-W平衡（P<0.05），SNP2（第10外显子rs313490398）、SNP3（第12外显子rs16594209）和SNP4（第7外显子rs313831938）均处于H-W平衡状态（P>0.05）。SNP1位点遗传多样性较低（PIC<0.25）。其他3个突变位点 0.25<PIC<0.5，为中度多态。

2.3　单标记与皮肤亮度L*值性状的关联分析

SLC38A11基因4个SNPs位点与背部、胸部和大腿部皮肤亮度L*值的关联性分析结果表明（表3），4个SNPs位点不同基因型间背部皮肤和大腿部皮肤亮度L*值均差异不显著。3个位点（SNP1~SNP3）不同基因型胸部皮肤亮度L*值差异显著， SNP4位点不同基因型间胸部皮肤亮度L*值无显著差异。SNP1（rs 740324212）位点在TC基因型的皮肤亮度L*值显著低于CC和TT基因型（P<0.05）；SNP2（rs313490398）位点AA基因型的皮肤亮度L*值显著低于GG与GA基因型（P<0.05）；SNP3（rs16594209）位点TT基因型的皮肤亮度L*值显著高于CC与CT基因型（P<0.05）。

2.4　连锁不平衡分析

连锁不平衡分析结果见图2。图2（a）方框中的数值为D’值乘以100后得到。由图2（b）可见，丝羽乌骨鸡SLC38A11的4个SNPs位点构建了1个连锁不平衡（LD）Block（单倍型区块）。Block1由3个SNPs位点（SNP2、SNP3和SNP4）构成，SNP2~SNP4存在强连锁关系，D’值均为1。SNP2、SNP3和SNP4之间的连锁产生了3种单倍型：H1（AGC）、H2（GGC）和H3（AAT），单倍型频率分别为0.443、0.367和0.190。

2.5　 SLC38A11单倍型与皮肤亮度L*值性状关联分析

SNP2、SNP3和SNP4连锁产生的3种单倍型组合后产生了6种基因型（表4）。由表4可见，关联分析发现，H3H3单倍型（AATTAA基因型）胸部皮肤亮度L*值较低，显著低于单倍型H2H3（GACTAG）和H2H1（GGCCAA），但6种单倍型组合个体间的背部和大腿部皮肤亮度L*值均差异不显著。

SNP1~SNP4 4个位点处的基因型合并后，基因型与皮肤亮度L*值相关性分析结果见表5。由表5可见，将 SNP1～SNP4处的基因型组合后，个体数小于3的单倍型组合不参与统计与比较，所以有8种基因型组合，其中TCAATTAA胸部皮肤亮度L*值较低，显著低于CCGGCCAA、TTGACTAG和CCGACTAG，但8种基因型的个体间背部皮肤和腿部皮肤亮度L*值均差异不显著。

3　讨　论

SLC38A11第11外显子rs740324212 C>T（SNP1）为错义突变，由疏水性的丙氨酸（GCG）变成了亲水性的组氨酸（GTG）。氨基酸及其特性的改变会导致蛋白质的结构与功能发生变化，进而影响相关基因的表达调控^［22］。错义突变的结果通常能使多肽链丧失原有功能，引起蛋白质功能改变，进而引起表型变化^［23］。岳舟等^［21］研究发现兰坪乌骨绵羊SLC17A8基因有11个SNPs，其中2个位点为错义突变，可能影响机体内部糖蛋白的构象，从而影响其乌质性状。本研究发现SLC38A11基因rs740324212 C>T位点的突变后，丝羽乌骨鸡群体TC基因型个体乌色度较高，说明该SNP位点为有益突变，该位点影响胸部皮肤乌色度的关键致因突变以及作用机制，需要扩大群体在细胞和蛋白水平进一步研究和验证。

通常用杂合度（He、Ho）和PIC用衡量群体遗传多样性的大小，多样性越高，则遗传丰富度也越高^［24］。SLC38A11基因4个SNPs位点，SNP1位点PIC=0.23（PIC<0.25），期望杂合度He=0.04和观察杂合度Ho=0.30均较低，说明群体内遗传变异较小。SNP2、SNP3和SNP4 3个突变位点具有中度多态性（0.25<PIC<0.5），He和Ho>0.30，说明这3个位点具有较高遗传多样性，遗传丰富度较高，能提供的选择效果更加丰富^［25］。H-W平衡假设的条件有群体足够大、随机交配、没有突变和迁移、没有基因型选择优势等^［26］。李青等^［25］研究结果表明由于人工配种、群体数量不够大等因素而出现一些基因位点偏离H-W平衡状态。本研究H-W平衡检验结果也显示，rs740324212 C>T（SNP1）偏离H-W平衡状态，这可能是由于公司对丝羽乌骨鸡非自然交配，而是进行人工选种选配，并对乌色度进行了多个世代的定向选育，导致部分SNP位点（SNP1）基因型的个体数量偏少所致，且偏离H-W平衡状态。另一方面，试验群体数量没有足够大，下一步将扩大群体进一步验证。

动物黑色素细胞源自于神经嵴，在胚胎发育早期成黑色素细胞由神经嵴细胞分化、迁移至体节中胚层，进入外胚层，通过胸侧途径迁向皮肤，最终形成表皮黑色素细胞。神经嵴细胞的迁移途径、分化趋势会受到多种因子的调控，继而影响黑色素细胞的生成和分布^［27-28］。本研究发现，SLC38A11基因单标记不同基因型、SNP2~SNP4强连锁后单倍型组合和SNP1~SNP4位点组合基因型与丝羽乌骨鸡胸部皮肤亮度L*值显著相关，而与背部皮肤和大腿部皮肤亮度L*值不相关。上述结果说明SLC38A11对黑色素沉积过程产生重要影响，可能对神经嵴细胞通过胸侧途径迁向胸部皮肤过程中发挥重要作用，从而对胸部皮肤黑色素沉积产生重要影响，后期将在细胞和蛋白水平进一步验证。诸多研究表明，皮肤和肌肉亮度L*值反映皮肤、肌肉表面的亮度，L*值越低，皮肤、肌肉颜色越暗，乌色度越高，黑色素含量越高，确立了亮度L*值可作为乌色度性状选育的参考指标^［29-31］。本研究也通过测定皮肤亮度L*值来反应皮肤乌色度。

单标记与皮肤亮度L*值相关性分析时，SLC38A11第7外显子rs313831938（SNP4 A>G）突变位点与皮肤乌色度不相关，但在连锁不平衡分析时发现该位点与SNP2和SNP3、SNP4位点存在强连锁状态，D’值均为1，且连锁后产生的AATTAA基因型胸部皮肤乌色度显著高于其他基因型个体。多个位点连锁后产生了优势基因型，对一些性状产生重要影响，与李青等^［25］、李王钰等^［32］研究结果相似。这也进一步证明表型的变化可能由单位点突变引起，也可能由多个突变位点连锁作用造成，连锁不平衡分析能够鉴别连锁的SNP位点，分析非等位基因间更多位点的相互作用，更深入的综合析表型变化原因^［33-34］。交配模式、群体混合和选择都将影响群体的SNP位点间出现连锁不平衡水平^{［25，35］}。本研究的试验材料丝羽乌骨鸡经历多个世代的人工选择，且为人工输精交配，这可能是SLC38A11基因多个SNPs位点间存在强连锁水平的重要原因。

SNP1~SNP4 4个SNPs位点基因型合并后，TCAATTAA基因型胸部皮肤亮度L*值较低，乌色度较高，后期将扩大群体进一步验证，以更快地推动乌色度高的丝羽乌骨鸡分子标记辅助育种进展，为定向培育乌色度高的屠宰型乌骨鸡新品种或专门化品系提供一定的参考依据。

4　结　论

SLC38A11基因与丝羽乌骨鸡胸部皮肤乌色度密切相关，TCAATTAA基因型可作为研究丝羽乌骨鸡胸部皮肤乌色度的候选分子标记，本研究为下一步利用分子标记辅助育种加快培育乌色度高的丝羽乌骨鸡新品种提供参考。

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基金资助

江苏省农业自主创新基金项目（CX（21）2011-1）

江苏省种业振兴揭榜挂帅项目(JBGS［2021］107)

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-41)

扬州市现代农业项目(YZ2021029)

江苏省现代农业产业技术体系（JATS(2023J396)