茉莉酸类物质是一类天然的植物生长调节剂,对植物生长发育、抗逆性以及次级代谢产物的合成具有重要的调控作用
[1]。其中,茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)具有安全无毒和环境友好的特点,外源喷施MeJA会影响花和果实中香气物质的合成
[2-4]。将MeJA溶液喷施于玫瑰的花蕾和周边叶片上,在半开期玫瑰花的香气总量以及香茅醇、乙酸苯乙酯、乙酸香茅酯和乙酸香叶酯等物质的含量显著增加
[2]。MeJA处理高丛越橘果实后,检测出正庚醛、乙酸己酯、α-蒎烯和β-罗勒烯等香气物质,它们可修饰果实的整体香气
[3]。外源喷施MeJA还可提高木莓、草莓、黑莓果实中萜烯类和β-紫罗兰酮的含量
[4]。
香气是葡萄酒感官特性的重要指标之一。研究表明,MeJA处理葡萄会影响果实和葡萄酒中香气物质的组成和含量
[5-8]。MeJA处理‘美乐’叶片后,葡萄酒中酯类和醇类总量增加,且香气物质的种类由60种增加到64种
[5]。MeJA处理‘桑娇维塞’果实,可提高果实中醇类、苯基化合物和萜烯类物质的含量,且处理组果实中香气总量分别是对照组的1.96和2.94倍,提高幅度较大
[6]。外源喷施MeJA可增加‘蛇龙珠’‘贵人香’葡萄和葡萄酒中单萜类化合物的含量和种类,转录组数据表明单萜合成途径中关键酶基因受MeJA诱导上调表达
[7-8]。
‘小白玫瑰’(Vitis vinifera L. cv. Muscat Blanc)和‘玫瑰香’(Vitis vinifera L. cv. Muscat Hamburg)属于麝香型葡萄,含有丰富的萜烯类物质,具有明显的玫瑰花香气,既可以鲜食又可以酿酒。如何提高麝香葡萄酒中萜烯类物质的含量,从而提高葡萄酒的香气质量,是目前亟待解决的问题。本研究在葡萄果实表面外源喷施MeJA溶液,通过检测葡萄酒的基本理化指标和挥发性成分以及进行感官分析,探索MeJA处理对‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒香气质量的影响,以期为提高麝香葡萄酒的品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验地点
山西农业大学果树研究所葡萄资源圃(112.5° E,37.4° N)。
1.2 材料及试剂
试验材料:‘小白玫瑰’和‘玫瑰香’葡萄均为11年生自根苗,株距0.8 m,行距2.5 m,南北行向,采用厂字形整形方式。
酵母:安琪CECA酵母。
试剂:茉莉酸甲酯、乙醇、氢氧化钠、斐林试剂、葡萄糖、次甲基蓝、亚硫酸、果胶酶、福林-肖卡试剂和碳酸钠等。
1.3 试验方法
1.3.1 MeJA处理
选取健康的‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄植株,于转色期在葡萄果实表面喷施10 mmol/L MeJA溶液(含0.1%吐温80),以喷施含吐温80的蒸馏水作为对照。
1.3.2 酿造工艺
‘小白玫瑰’葡萄酒酿造工艺:将葡萄除梗、破碎、压榨,用无菌纱布过滤后,将葡萄汁装入10 L玻璃罐中,3次重复。加入50 mg/L二氧化硫,30 min后加入40 mg/L果胶酶,常温静置24 h。用10倍质量、37 ℃的水溶解酿酒酵母,然后在37 ℃水浴锅中静置20 min,将活化好的酵母按照200 mg/L加入到葡萄汁中,启动酒精发酵。每隔24 h监测葡萄酒的温度和比重,待比重不再下降时,添加50 mg/L二氧化硫终止发酵,将葡萄酒装瓶待测。
‘玫瑰香’葡萄酒酿造工艺:将葡萄除梗、破碎后,将葡萄醪装入10 L玻璃罐中,3次重复。依次加入二氧化硫、果胶酶和酿酒酵母,操作方法同上。发酵结束后,过滤除去皮渣,将葡萄酒装瓶待测。
1.3.3 基本理化指标测定
葡萄酒中还原糖、总酸、pH、酒精度、挥发酸和总酚含量的测定参考《葡萄酒分析检验》
[9]。
1.3.4 香气物质测定
将5 mL酒样放入样品瓶中,加入2 g NaCl和100 μL内标2-辛醇(100 mg/L),40 ℃平衡10 min,固相微萃取头吸附30 min,毛细管柱为TG-WAX(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。升温程序为40 ℃保持3 min,以7.0 ℃/min升至230 ℃,保持8 min;进样口250 ℃;传输线230 ℃;载气He,流速1.0 mL/min;不分流进样。电离方式为电子电离,离子能量70 eV,离子源温度230 ℃,质量扫描范围33~450 amu,发射电流100 μA,检测电压1.4 kV。用2-辛醇作内标计算各组分相对含量,设3次技术重复
[10]。
1.3.5 感官评价方法
成立20人的感官评价小组,对葡萄酒的外观、香气、滋味和典型性进行打分,总分100分,并描述其感官特性。
1.3.6 统计分析
采用SPSS 21软件对数据进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 MeJA处理对葡萄酒基本理化指标的影响
对酒样进行基本理化指标测定,结果如
表1所示。本试验用‘小白玫瑰’‘玫瑰香’酿造的酒样中还原糖质量浓度均小于4.00 g/L,属于干型葡萄酒。MeJA处理后,‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒pH小于对照;总酸质量浓度高于对照,分别增加了3.5%和7.3%;同时酒精度显著高于对照组,分别增加了1.6%和4.8%。挥发酸可以反映葡萄酒的健康状况,是葡萄酒发酵和贮藏管理不当的产物。本试验中4种葡萄酒中挥发酸质量浓度均低于0.40 g/L,远低于国标要求的1.20 g/L。‘玫瑰香’葡萄酒中总酚质量浓度显著高于‘小白玫瑰’葡萄酒,而且MeJA处理显著提高了葡萄酒中总酚质量浓度,与对照组相比,‘玫瑰香’和‘小白玫瑰’处理组中总酚质量浓度分别增加了20.10%和56.49%。
2.2 MeJA处理对葡萄酒挥发性成分的影响
葡萄酒的香气不仅反映了酿酒葡萄的品种特色,还决定了葡萄酒的风味和典型性,是衡量葡萄酒质量的重要指标。本研究采用GC-MS对葡萄酒的挥发性成分进行检测(
表2),结果显示,在‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒中共检测出39种挥发性成分,包括7种醇类、23种酯类、8种萜烯类和1种降异戊二烯类物质;‘小白玫瑰’对照组和处理组酒样中挥发性物质总量分别为3 824.76和4 977.29 μg/L;‘玫瑰香’对照组和处理组酒样中挥发性物质总量分别为12 233.01和14 289.35 μg/L。由此可知,MeJA处理显著提高了葡萄酒中挥发性物质总量,有利于改善葡萄酒的香气质量。
2.2.1 醇类物质
葡萄酒中的醇类物质大多是酒精发酵的副产物,会增加葡萄酒中的化学气味、辛辣味和草药味,但由于其在酒中的比例和质量浓度不同,葡萄酒可能散发悦人的花香和果香
[11]。在‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒中检测到戊醇、3-甲基-2-己醇、异戊醇、己醇、庚醇、6-甲基-2-庚醇和苯乙醇这7种醇类物质(
表2),其中质量浓度最高的是异戊醇(共1 075.30 μg/L),占醇类物质总量的76.53%,该物质具有杂醇油的气味。戊醇具有香草味和辛辣味,在‘小白玫瑰’‘玫瑰香’处理组酒样中的质量浓度分别为0.40和18.51 μg/L,而在对照组中未检出。苯乙醇具有明显的玫瑰花香,在MeJA处理后‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒中苯乙醇质量浓度分别增加了44.03和12.11 μg/L,可使葡萄酒的花香更浓郁。
2.2.2 酯类物质
酯类物质可赋予葡萄酒丰富的果香和花香,在葡萄酒中质量浓度高、种类多,对葡萄酒香气影响较大。与对照组相比,‘小白玫瑰’‘玫瑰香’处理组中酯类物质质量浓度分别增加了776.40和1 720.34 μg/L(
表2)。4个酒样中共有的酯类物质包括6种,分别是乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、4-乙酸松油烯酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯,其中质量浓度最高的是辛酸乙酯,可赋予葡萄酒菠萝、梨等果香和花香。MeJA处理后‘小白玫瑰’葡萄酒中辛酸乙酯显著增加,而‘玫瑰香’葡萄酒中该物质有所降低;处理组酒样中丁酸乙酯、乙酸异戊酯和癸酸乙酯质量浓度显著增加,具有草莓、苹果和香蕉等果香以及脂肪味。此外,在‘小白玫瑰’葡萄酒中检测到较高浓度的己酸乙酯(>600 μg/L),具有香蕉、菠萝、草莓和青苹果等果香,在MeJA处理后质量浓度显著增加;在‘玫瑰香’葡萄酒中检测到较高浓度的己酸甲酯(>700 μg/L),具有菠萝的香气,在MeJA处理后质量浓度有所降低。
2.2.3 萜烯类物质
葡萄酒中萜烯类物质来自葡萄果实,是麝香型葡萄和葡萄酒的典型香气物质
[12]。在本研究中共检测到8种萜烯类物质,MeJA处理后‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒中萜烯类物质总量分别增加了34.44%和30.96%(
表2)。4个酒样中共有的萜烯类物质包括反式-β-罗勒烯、芳樟醇、松油醇和香叶醇,在MeJA处理后,芳樟醇质量浓度显著增加,赋予葡萄酒柑橘、紫丁香、铃兰和玫瑰花的香气。在‘小白玫瑰’处理组酒样中反式-β-罗勒烯、松油醇、香叶醇的质量浓度显著高于对照组。在‘玫瑰香’处理组酒样中β-月桂烯、D-柠檬烯和香茅醇质量浓度显著高于对照组,这些物质具有香脂、柠檬、柑橘和玫瑰花等香气。
2.2.4 降异戊二烯
在‘玫瑰香’葡萄酒中检测到较高浓度的β-紫罗兰酮,该物质属于降异戊二烯,具有紫罗兰和玫瑰花的香气。在MeJA处理后,‘玫瑰香’葡萄酒中β-紫罗兰酮增加了0.54 μg/L。
2.2.5 主成分分析
对葡萄酒中的香气物质进行主成分分析,结果显示PC1和PC2分别解释了数据总方差的72.85%和15.83%,累计为88.68%(
图1)。‘玫瑰香’位于PC1的正向端,而‘小白玫瑰’位于PC1的负向端;2种葡萄的对照位于PC2的负向端,而处理组位于PC2的正向端。4个酒样分布于4个象限,说明不同品种和MeJA处理对葡萄酒香气物质的影响差异明显,可以用主成分分析法进行区分。以香气成分在2个主成分上的载荷做图,结果显示,最能反映‘小白玫瑰’处理与其他酒样香气差异的物质包括8种酯类(丙酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、月桂酸乙酯、丙酸戊酯、己酸丁酯、3-甲基丁酸乙酯和己酸乙酯)和3种萜烯类(芳樟醇、反式-β-罗勒烯和香叶醇);最能反映‘玫瑰香’处理与其他酒样香气差异的物质包括5种醇类(戊醇、异戊醇、苯乙醇、己醇和庚醇)、7种酯类(辛酸丙酯、癸酸乙酯、辛酸异戊酯、癸酸异戊酯、乙酸异戊酯、辛酸异丁酯和乙酸薰衣草酯)和3种萜烯类(β-月桂烯、D-柠檬烯和香茅醇)。上述香气物质在对应酒样中的质量浓度明显高于其他酒样。由此可知,MeJA处理可以导致葡萄酒中某些香气物质的质量浓度差异。
2.2.6 关键香气物质分析
气味活性值(OAV)是香气物质的浓度与嗅觉阈值的比值,可用来表示香气物质对葡萄酒香气的贡献。在‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒中OAV值大于1的香气物质分别有9和11种(
表3),二者共有的特征香气物质包括丁酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯和芳樟醇,其中OAV值最大的是辛酸乙酯,对葡萄酒香气贡献最大。β-紫罗兰酮在‘玫瑰香’葡萄酒中质量浓度很低(<4 μg/L),但是由于该物质的嗅觉阈值仅有0.007,所以OAV值较大(>500),对葡萄酒香气贡献较大。由此可知,香气物质对葡萄酒香气的贡献与物质含量不成正比,而是与OAV值有关,OAV值越大,对香气影响越大。
结合主成分分析结果,确定MeJA处理后,丁酸乙酯、己酸丁酯、己酸乙酯、芳樟醇、反式-β-罗勒烯和香叶醇对‘小白玫瑰’葡萄酒的香气影响较大,而癸酸乙酯、乙酸异戊酯、β-月桂烯、D-柠檬烯和香茅醇对‘玫瑰香’葡萄酒的香气影响较大。
2.3 MeJA处理对葡萄酒感官特性的影响
品尝小组对本试验的酒样进行感官评分,结果如
表4所示。MeJA处理后2个品种葡萄酒的总分均显著提高,达到80分以上。‘小白玫瑰’葡萄酒呈浅禾杆黄色,具有玫瑰花、茉莉花和荔枝等香气,与对照组相比,处理组酒样中花香更加突出。‘玫瑰香’葡萄酒呈浅宝石红,处理组颜色明显深于对照组,而且处理组中香蕉和草莓的香气更加浓郁,类似于博诺莱新酒,可能与酯类物质质量浓度增加有关。
3 讨论与结论
在本研究中,用MeJA溶液喷施‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄果实,果实成熟后酿酒,并检测酒样中的香气成分,结果显示,处理组酒样中香气物质总量及醇类、酯类、萜烯类物质总量均显著提高。有研究表明,MeJA处理‘黑比诺’果实,可显著增加果实中香气物质总量和脂肪酸代谢产生的香气物质的质量浓度
[13]。
葡萄酒中醇类物质一部分来自酒精发酵,如戊醇、庚醇和苯乙醇等;一部分来自葡萄果实,如己醇。己醇是C6醇,具有青草的香味,属于绿叶挥发物(GLV),是葡萄果实中重要的香气成分,而脂氧合酶(LOX)是GLV生物合成途径中的关键酶
[14]。研究发现外源喷施MeJA可增加‘赤霞珠’‘丹魄’果实中己醇质量浓度,并激活果实中LOX酶活性
[15-16]。在本研究中,MeJA处理后‘玫瑰香’葡萄酒中己醇质量浓度显著提高,可能是由于MeJA激活了‘玫瑰香’果实中LOX基因导致。总体来说,MeJA处理后葡萄酒中戊醇、异戊醇、庚醇和苯乙醇质量浓度虽然有所提高,但是OAV值均小于1,对于葡萄酒香气的影响较小。
酯类是‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒中质量浓度最高的一类香气物质,酒样中共有的特征酯类物质包括丁酸乙酯、乙酸异戊酯和辛酸乙酯,其中辛酸乙酯的OAV值最大,赋予葡萄酒花香和果香。李凯等
[17]用不同酵母发酵‘玫瑰香’,结果显示葡萄酒中OAV值最大是辛酸乙酯,OAV值为418.85~635.79,而且丁酸乙酯和乙酸异戊酯的OAV值大于1,与本研究结果一致。说明丁酸乙酯、乙酸异戊酯和辛酸乙酯是麝香型葡萄和葡萄酒的特征香气物质。本试验在MeJA处理后,‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒中丁酸乙酯和乙酸异戊酯的质量浓度增加,而辛酸乙酯在‘小白玫瑰’处理组中增加,在‘玫瑰香’处理组中降低。赵婉珍等
[5]研究发现MeJA处理‘美乐’叶片后,葡萄酒中酯类总量增加,但辛酸乙酯质量浓度降低。MeJA处理还可提高‘南国梨’果实中酯类物质的质量浓度,与LOX途径中相关基因被激活有关
[18]。关于MeJA对葡萄和葡萄酒中酯类物质的影响有待进一步研究。
萜烯类物质是麝香葡萄的特征香气物质,包括半萜烯(C5)、单萜烯(C10)、倍半萜烯(C15)、二萜烯(C20)和四萜烯(C40),其中单萜化合物是最丰富的,如芳樟醇、橙花醇、萜品醇、香叶醇和香茅醇
[16]。由于单萜化合物阈值较低,因此其种类和质量浓度对葡萄酒的香气影响较大。在‘蛇龙珠’转色初期和转色中期用MeJA处理果实,葡萄酒中芳樟醇、香茅醇和香叶酸等单萜化合物的质量浓度显著升高
[7];D’Onofrio等
[6]对桑娇维塞果实进行MeJA处理,处理组葡萄酒中游离态单萜化合物质量浓度是对照组的7.39倍,而且检测到的16种单萜化合物的质量浓度均显著增加
[6]。以上结果均与本研究结果一致。一方面,MeJA可提高葡萄果实中β-糖苷酶的活性,有利于单萜化合物由结合态转变为游离态,对葡萄酒品种香气的释放具有积极作用
[7];另一方面,MeJA可以促进葡萄果实中萜烯类物质生物合成途径中关键酶基因的表达,如单萜合成酶基因(
TPS)
[19-20]和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因(
DXS)
[6,8,21-22]。本研究未对葡萄果实中萜烯类物质合成相关基因进行分析,今后将对MeJA提高葡萄萜烯类物质的分子机制进行深入研究。
此外,本研究中MeJA处理显著增加了‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒中总酚质量浓度,而且由于‘玫瑰香’葡萄酒中花色苷增加,处理组酒样的颜色深于对照组,可能是由于MeJA促进了葡萄果皮中花色苷的生物合成。有研究表明,MeJA处理可以提高‘克森无核’
[1]、‘新郁’
[23]、‘黑比诺’
[24-25]、‘马瑟兰’
[25]和‘美乐’
[5]等葡萄果皮中花色苷质量浓度,与本研究结果一致。
通过香气物质的检测和分析,确定‘小白玫瑰’‘玫瑰香’葡萄酒主要特征香气物质为辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯和芳樟醇,其中辛酸乙酯的OAV值最大,对葡萄酒香气贡献最大。在MeJA处理后,‘小白玫瑰’葡萄酒的花香明显提升,‘玫瑰香’葡萄酒的果香明显提升,说明MeJA处理有利于改善麝香型葡萄酒的香气质量。本研究结果为进一步探索MeJA影响葡萄果实中萜烯类物质合成的分子机理奠定基础。
山西省科技厅基础研究计划项目(20210302124147)