肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌抑制作用及机理的初步研究

Inhibitory effect of Cinnamon essential oil on Valsa mali and Botrytis cinerea and the preliminary study of its mechanism

摘要

为探明肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用并初步探究其对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的抑制机理，使用菌丝生长速率法和熏蒸法观察不同质量浓度肉桂精油处理下苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的菌落直径，测定肉桂精油对苹果腐烂病和番茄灰霉病的活体组织抑制效果，探究肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌菌体的形态变化、细胞膜通透性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）、可溶性蛋白和还原糖含量的变化规律。结果表明：1）菌丝生长速率法测得肉桂精油质量浓度为250 mg/L时，对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌抑菌率分别为98.31%和99.06%；熏蒸法测得肉桂精油质量浓度为8 000 mg/L时，对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌抑菌率分别为50.57%和58.79%。2）当肉桂精油质量浓度为5 000 mg/L时，对苹果腐烂病和番茄灰霉病活体抑制效果分别为54.30%和64.10%。3）经肉桂精油处理后的苹果腐烂病菌菌丝和番茄灰霉病菌菌丝干瘪、坍塌，表面有分叉，菌液电导率上升，菌体SOD酶活性下降，MDA含量上升，可溶性蛋白和还原糖含量下降，最终扰乱菌体各项生理生化反应，进而达到抑菌效果。本研究可为开发防治苹果腐烂病和番茄灰霉病的植物源农药提供依据。

Abstract

In order to investigate the inhibitory effect of Cinnamon essential oil （CEO） on Valsa mali and Botrytis cinerea and investigate its inhibitory mechanism， the mycelial growth rate and fumigation methods were adopted to observe the colony diameters of Valsa mali and Botrytis cinerea in different mass concentrations of CEO and the inhibitory effects of CEO on Valsa mali and Botrytis cinereain vivo were determined. The effects of CEO on the morphology， cell membrane permeability， superoxide dismutase （SOD） enzyme activity， malondialdehyde （MDA） content， soluble protein content and reducing sugar content of the mycelium of Valsa mali and Botrytis cinerea were investigated. The results showed that： 1） When the mass concentration of CEO was 250 mg/L， the inhibition rates of Valsa mali and Botrytis cinerea measured by mycelial growth rate method reached 98.31% and 99.06%， respectively； When the mass concentration of CEO was 8 000 mg/L， the inhibition rates of Valsa mali and Botrytis cinerea measured by fumigation method were 50.57% and 58.79%， respectively. 2） When the mass concentration of CEO was 5 000 mg/L， the in vivo inhibitory effects on Valsa mali and Botrytis cinerea was 54.30% and 64.10%， respectively. 3） The mycelia of Valsa mali and Botrytis cinerea treated with CEO were dried out， collapsed with bifurcation on the surface， and the bacterial liquid conductivity increased， the bacterial SOD enzyme activity decreased， MDA content increased， soluble proteins and content of reducing sugar decreased. Ultimately disturbed the physiological and biochemical reactions of the bacterium and achieved the effect of bacterial inhibition. This study provided a scientific basis for the development of plant-derived pesticides for the control of Valsa mali and Botrytis cinerea.

Graphical abstract

关键词

肉桂精油 / 苹果腐烂病菌 / 番茄灰霉病菌 / 抑菌作用 / 酶活性 / 膜通透性

Key words

Cinnamon essential oil / Valsa mali / Botrytis cinerea / bacteriostatic effect / enzyme activity / membrane permeability

苹果和番茄在水果与蔬菜中最为常见，是我国重要的经济作物。我国是世界第一大苹果和番茄生产国，苹果种植面积及产量约占世界40%以上，番茄年产量可达6 700万t^［1-2］。苹果腐烂病又称苹果树腐烂病，由苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）侵染引起，在我国分布范围广且防治困难。该病不仅会造成果实严重减产，还会危害苹果树主干和枝干，最终导致苹果树死亡，甚至整个果园毁灭，因此又被称为苹果树的“癌症”^［3-6］。番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的一种传播速度快且危害严重的世界性番茄真菌性病害。番茄灰霉病感染能力强，蔓延速度快，可导致番茄减产60%左右，严重时整株果实全部腐烂，对番茄种植和番茄产量产生极大威胁^［7］。苹果腐烂病和番茄灰霉病严重影响苹果和番茄产量，造成巨大经济损失，因此如何安全有效地防治苹果腐烂病和番茄灰霉病成为提高苹果和番茄产量的一个重要前提。

目前，防治苹果腐烂病和番茄灰霉病的主要方式是使用化学药剂。然而，化学农药的长期不合理使用不仅严重破坏了生态环境，对人类健康和农业生产构成了严重威胁，还易使病菌产生抗药性，从而极大地降低了防治效果。植物源农药因不易产生抗药性，对非靶标生物安全，环境相容性好，是未来农药研究发展的一个重要方向。植物精油是一种存在于植物不同组织中的一类次生物质，由于精油的生物活性，近年来在农药领域中的研究与应用日渐增多，现有研究表明因其富含萜类和酚类化合物，具有抑制病原微生物生长和防腐保鲜的作用^［8］。

肉桂属于樟科植物，原产于中国，是一种药用价值极高的中国传统中药。肉桂精油是从干燥的肉桂皮中萃取得到的挥发油，是一类具有广谱抑菌性能的物质^［9］。作为一种无毒害、无污染、无残留、低成本且活性高的天然的具有较强抑菌活性的提取物，肉桂精油在食物保鲜防腐及防治水果采摘后致腐菌感染方面已经有广泛应用^［10-13］。在植物保护方面，现有研究证实肉桂精油对苹果灰霉病菌具有抑菌活性，肉桂精油主要成分肉桂醛对番茄灰霉病菌具有抑菌活性，可以抑制病原菌菌丝生长^［14-15］。但是肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌抑制效果及机理方面的研究却鲜有报道。

本研究通过测定肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌抑菌活性及活体抑制效果，从显微结构、细胞膜通透性、超氧化物歧化酶（SOD）酶活性、丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量和还原糖含量方面初步探究肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的作用机理，为肉桂精油农药的开发与应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

2种植物病原真菌（苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌）由青岛农业大学绿色农药研究所提供，于4 ℃条件下保存。将保存的菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar，PDA）培养平板上进行活化，置于26 ℃恒温培养箱中培养至菌丝长满整个平板，使用直径6 mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼，备用。肉桂精油购于江西中环新材料有限公司，PDA培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基（Potato dextrose broth，PDB）购于青岛海博生物技术有限公司，SOD试剂盒购于碧云天生物技术有限公司，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和葡萄糖（无水）购于国药集团化学试剂有限公司，3，5-二硝基水杨酸（DNS）购于上海麦克林生化科技有限公司，MDA试剂盒、考马斯亮蓝-G250和牛血清蛋白购于北京索莱宝有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1　肉桂精油溶液的配制

准确称取肉桂精油800 mg，使用2%吐温-80溶解，配置成8 000 mg/L的肉桂精油储备液。

1.2.2　2种植物病原真菌抑菌活性测定

1.2.2.1　生长速率法

采用生长速率法^［16］测定肉桂精油对病原菌的抑菌活性。使用储备液配制质量浓度为250、200、150、100、50和25 mg/L的含药PDA培养基，摇匀后倒板，另设空白对照组。待琼脂凝固后在平板中央分别接种直径为6 mm的真菌菌饼（苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌），每个平板每次处理3次重复，置26 ℃恒温培养。4 d后用十字交叉法测量菌落直径，按照公式（1）计算抑制率。采用浓度对数-抑制率概率值法求取毒力回归方程及半数效应浓度（EC₅₀）^［17-18］。

\mathrm{抑制}\mathrm{率}=\frac{D_{\mathrm{1}}-D_{\mathrm{2}}}{D_{\mathrm{1}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（1）

式中：D₁为对照组菌落生长直径，cm；D₂为处理组菌落生长直径，cm。

1.2.2.2　熏蒸法

采用熏蒸法^［19］测定肉桂精油对病原菌的抑菌活性。在PDA平板中央分别接种直径为6 mm的真菌菌饼（苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌），在培养皿盖内放置无菌滤纸片，在滤纸片上滴加100 μL肉桂精油药剂，质量浓度分别为8 000、6 000、4 000、2 000和1 000 mg/L，另设空白对照组。每个平板每次处理3次重复，置26 ℃恒温培养。4 d后用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。

1.2.3　2种植物真菌病活体抑制效果测定

肉桂精油对苹果腐烂病、番茄灰霉病抑制效果采用活体试验进行检测。使用6 mm打孔器分别在苹果和番茄表皮上打孔，在孔内分别接种苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌菌饼，置于塑料保鲜盒中，25 ℃培养。使用肉桂精油储备液配制质量浓度分别为5 000、4 000、3 000、2 000、1 000、500、250和125 mg/L的肉桂精油溶液装入喷壶中，另设空白对照组，每个浓度3组重复。待空白组创孔周围开始生长菌丝或者开始腐烂，将对应精油均匀喷洒在果实表面，每日重复1次，5 d后测量病斑直径，计算抑制率。

1.2.4　菌丝形态测定

配制含药PDA培养基，质量浓度分别为50和150 mg/L，另设空白对照组。在培养基表面铺上一层无菌玻璃纸，将苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌菌饼分别接种在平板中央，2 d后取下玻璃纸上的菌丝，固定、冲洗、脱水、干燥，通过扫描电镜观察菌丝形态。

1.2.5　细胞膜通透性测定

采用电导率法^［20］，将菌丝放入PDB培养基中摇晃培养3 d，分离琼脂，吸干水分。分别称取2种病原真菌各1.5 g菌丝均分为6份，分别加到肉桂精油质量浓度为100、75、50、25和12.5 mg/L的去离子水中，对照组加上等量的去离子水，在环境条件为25 ℃分别测定0、1、2、4、6和8 h电导率。根据电导率变化，观察肉桂精油对细胞膜通透性的影响。

1.2.6　超氧化物歧化酶活性测定

配制含肉桂精油溶液的PDB培养基，质量浓度分别为100、75、50、25和12.5 mg/L，摇匀后每个锥形瓶倒入100 mL含药培养基，另设空白对照组。每个锥形瓶中放入3个6 mm菌饼，每个处理3次重复，封口置25 ℃摇床中摇晃培养；3 d后将菌团取出，分离琼脂，冲洗3次；将菌丝冰浴研磨成匀浆后离心；取上清液，使用SOD试剂盒处理上清液。SOD酶活性测定将450和600 nm吸光度下以黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时定义为1个活性单位（unit）。

1.2.7　丙二醛含量测定

按照1.2.6取菌丝方法，将菌丝冰浴研磨成匀浆后离心，取上清液，使用MDA试剂盒处理上清液，使用酶标仪在532 nm波长下检测样本中MDA的含量。

1.2.8　可溶性蛋白含量测定

配制磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白液和考马斯亮蓝G-250溶液，制作可溶性蛋白标准曲线。按照1.2.6取菌丝方法，将菌丝冰浴研磨成匀浆后离心，取上清液，加入考马斯亮蓝工作液，于595 nm吸光度下测定数值。可溶性蛋白含量计算公式如下：

\mathrm{可溶}\mathrm{性蛋}\mathrm{白含}\mathrm{量}=\frac{\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值对}\mathrm{应蛋}\mathrm{白质}\mathrm{含量}\times \mathrm{提取}\mathrm{液体}\mathrm{积}}{\mathrm{测定}\mathrm{液体}\mathrm{积}\times \mathrm{样品}\mathrm{鲜重}}\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{3}}（2）

1.2.9　还原糖含量测定

配制葡萄糖溶液、3，5-二硝基水杨酸溶液，制作还原糖标准曲线。按照1.2.6取菌丝方法，将菌丝冰浴研磨成匀浆后离心，取上清液，加入DNS工作液，于540 nm吸光度下测定数值。还原糖含量计算公式如下：

\mathrm{还原}\mathrm{糖含}\mathrm{量}=\frac{\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值对}\mathrm{应还}\mathrm{原糖}\mathrm{含量}\times \mathrm{提取}\mathrm{液体}\mathrm{积}}{\mathrm{测定}\mathrm{液体}\mathrm{积}\times \mathrm{样品}\mathrm{鲜重}}\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{3}}（3）

1.3　数据处理及分析

采用SPSS和Excel 2021进行数据统计和绘图；利用GraphPad Prism 8.0进行数据的方差分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1　肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌生长的抑制作用

2.1.1　生长速率法测定对2种植物病原真菌生长的抑制作用

生长速率法可评价杀菌剂直接接触病原菌的杀菌活性。由图1可知，肉桂精油对苹果腐烂菌和番茄灰霉菌的抑制率呈剂量依赖性，抑制效果随肉桂精油质量浓度升高而增强，当质量浓度大于50 mg/L时抑制率极显著高于对照组（P<0.01）。当肉桂精油质量浓度达到250 mg/L时，对苹果腐烂菌和番茄灰霉菌的抑制率分别达到98.31%和99.06%。进一步建立其毒力回归方程，计算EC₅₀，结果见表1。可知肉桂精油对苹果腐烂菌和番茄灰霉菌的EC₅₀分别为119.85和113.39 mg/L，对番茄灰霉病菌的抑制效果略强于苹果腐烂病菌。

2.1.2　熏蒸法测定对2种植物病原真菌生长的抑制作用

由于肉桂精油具有挥发性，因此选用熏蒸法评价肉桂精油在气体状态下的抑菌效果，对肉桂精油的抑菌效果进行再次验证（图2）。当肉桂精油质量浓度升高，2种病原真菌生长繁殖受到抑制；当肉桂精油质量浓度达到8 000 mg/L时，抑制率极显著高于对照组（P<0.01），其对苹果腐烂菌和番茄灰霉菌的抑制率分别为50.57%和58.79%。进一步建立其毒力回归方程，计算EC₅₀，结果见表2。肉桂精油对苹果腐烂菌和番茄灰霉菌的EC₅₀分别为8 221.36和6 975.05 mg/L。比较生长速率法和熏蒸法测定效果，生长速率法抑菌效果明显强于熏蒸法，说明肉桂精油虽然具有挥发性，但是并不适用于熏蒸法抑菌。

2.2　肉桂精油对苹果腐烂病和番茄灰霉病活体抑制的效果

为了进一步评估肉桂精油对苹果腐烂菌和番茄灰霉菌的抑制效果，开展了肉桂精油对苹果腐烂病和番茄灰霉病活体组织抑制效果研究（图3（a））。随着肉桂精油质量浓度升高，病斑直径减小，抑制效果呈现出增强趋势，各处理组抑制率极显著高于对照组（P<0.01）（图3（b）~（c））。当肉桂精油质量浓度达到5 000 mg/L时，对苹果腐烂病抑制率为54.30%，对番茄灰霉病抑制率为64.10%。通过活体试验可知，肉桂精油可以抑制苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌对果实地侵染，对苹果腐烂病和番茄灰霉病具有一定的防治效果。

2.3　肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌超微结构的影响

为了探究肉桂精油的抑菌机理，使用扫描电子显微镜观察肉桂精油处理后2种植物病原真菌菌丝形态（图4）。对照组菌丝形态规则，菌丝表面光滑、粗细均匀；而处理组菌丝干瘪、坍塌，表面有分叉，说明肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌菌丝形态产生了影响。

2.4　肉桂精油对细胞膜通透性的影响

为了进一步探究肉桂精油对病原菌细胞膜的影响，使用电导率仪检测不同质量浓度肉桂精油处理后的菌液的电导率（图5）。随着肉桂精油质量浓度的升高以及处理时间的延长，2种病原真菌菌液电导率呈上升趋势，各个处理组电导率均极显著大于对照组（P<0.01）。这一结果说明肉桂精油破坏了苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的细胞膜，导致菌丝内电解质的渗出，表明肉桂精油增加了2种植物病原真菌细胞膜的通透性。

2.5　肉桂精油对超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影响

SOD和MDA是评估细胞膜脂质过氧化损伤程度的指标，为了证明肉桂精油破坏了病原真菌的细胞膜，本研究检测了肉桂精油处理后菌丝体SOD酶活性及MDA含量变化（图6）。肉桂精油质量浓度大于50 mg/L时，与对照组相比苹果腐烂菌菌体和番茄灰霉菌菌体SOD酶活性极显著下降（P<0.01），说明肉桂精油抑制了菌体内超氧化物歧化酶的活性。当肉桂精油质量浓度大于25 mg/L时，与对照组相比2种病菌菌体内MDA含量极显著上升（P<0.01）。综上所述，SOD酶活性的下降和MDA含量的升高证明病菌的细胞膜发生了脂质过氧化，这一结果最终导致菌的膜损伤。

2.6　肉桂精油对可溶性蛋白和还原糖含量的影响

细胞膜的破坏会影响细胞的正常生理代谢，为了证明肉桂精油会导致病原真菌代谢的紊乱，本研究检测了胞内蛋白和还原糖含量（图7）。当肉桂精油质量浓度升高时，与对照组相比苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌菌体可溶性蛋白含量极显著下降（P<0.01），还原糖含量显著下降（P<0.05）。说明肉桂精油可破坏菌丝体细胞膜结构，能造成菌丝体细胞可溶性蛋白和还原糖大量流失，扰乱菌体生理代谢过程，进而达到抑菌效果。

3　讨论与结论

本研究通过生长速率法和熏蒸法，证明肉桂精油对苹果腐烂菌和番茄灰霉菌有抑菌效果。但是生长速率法抑菌效果明显强于熏蒸法，说明肉桂精油虽然具有挥发性，但是并不适用于熏蒸抑菌，以直接接触的方式更有利于肉桂精油发挥抑制苹果腐烂菌和番茄灰霉菌的效果，这与贾会玲^［21］的研究结果一致。通过活体试验发现通过喷洒肉桂精油溶液可有效抑制苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌侵染果实。现有研究表明，肉桂精油处理后可有效降低果实贮存时的腐烂率，增强果实抗氧化能力，提升果实贮藏品质^［22-23］。鉴于其抑制病原菌侵染的特性，肉桂精油在苹果、番茄采后运输和贮藏过程中具有显著应用价值，可有效抑制病原真菌的侵染，从而保持果实的新鲜度。

病原菌细胞膜被破坏后，电解质外渗，胞外电导率增大，蛋白质类和糖类的减少也可间接反应病原真菌细胞结构的破坏^［24］。菌丝体保护酶可清除体内活性氧及过氧化物自由基，大量的活性氧对细胞具有破坏作用；而MDA是膜脂质过氧化终产物之一，它会损坏细胞膜结构，改变膜通透性，影响细胞正常生理生化反应^［25-26］。通过扫描电镜观察发现肉桂精油可使菌丝生长畸形，这与毛雪琳^［9］的结果一致。表明肉桂精油中的活性物质可破坏真菌结构和功能的完整性，对菌丝造成不可逆损伤，从而抑制菌丝生长^［27］。本研究发现，苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌经过肉桂精油处理后菌液电导率上升，说明肉桂精油可影响细胞膜通透性，导致电解质渗漏，破坏膜脂质双分子层结构和功能，阻碍细胞代谢功能^［28］。进一步测定发现菌丝体可溶性蛋白和还原糖含量显著下降，也说明了肉桂精油会破坏细胞膜完整性，使细胞表面损伤，大量内容物渗出，生长代谢紊乱从而导致病原菌细胞死亡。肉桂精油处理后菌体SOD酶活性下降，未及时清除的活性氧作用于细胞膜，导致膜脂质过氧化，破坏细胞结构。膜脂质过氧化产生大量MDA，致使细胞膜中的膜蛋白失活，通透性增加，影响各项生理生化功能，从而抑制病原菌生长繁殖。

本研究仅对肉桂精油抑制苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的机理进行了初步探究，为提高肉桂精油对病原菌的抑制效果及农药的合理应用，可对其抑菌机理进行深入研究。如可以通过分子层面探究肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的作用靶点。

植物源杀菌剂不易产生抗药性，对非靶标生物安全，环境相容性好，是未来农药研究发展的一个重要方向。本研究表明，肉桂精油通过破坏苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌细胞膜结构影响其生理代谢功能，有效抑制了病原真菌繁殖，为苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的防治提供了新方向，为新型无公害防治药剂的研制提供了基础理论依据和参考借鉴。

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基金资助

国家高层次人才计划项目(096-1717001)