一种导致浙江地区蝴蝶兰软腐病发生的病原菌分离鉴定及品种抗性评价

Isolation and identification of a pathogenic bacterium causing soft rot of Phalaenopsis in Zhejiang Province and variety resistance evaluation

摘要

为明确浙江地区蝴蝶兰软腐病的病原种类以及不同蝴蝶兰品种对软腐病的抗病性差异，采用形态学、生理生化特性研究和系统发育学对蝴蝶兰软腐病进行病菌分离鉴定，应用离体叶片接种法评估不同蝴蝶兰品种抗病性。结果表明：1）蝴蝶兰软腐病病原菌为革兰氏阴性菌，在营养琼脂培养基（不含葡萄糖）上菌落呈乳白色圆形或近圆形，在营养琼脂甘油锰培养基上菌落呈浅紫色，菌体呈杆状。2）基于16S rRNA、dnaX、gapA和recA基因构建多基因联合系统发育树，结果表明菌株B与Dickeya fangzhongdai B16为同一分支。3）对40个蝴蝶兰品种进行离体叶片抗软腐病评价，鉴定出1个高抗品种（‘ES L20’）、1个抗病品种、14个中抗品种、18个感病品种和6个高感品种。本研究鉴定出一种导致浙江地区蝴蝶兰软腐病的病原菌，提供了部分蝴蝶兰品种的抗软腐病信息，为深入研究该病害发生规律及防治，培育抗病品种提供理论依据。

Abstract

In order to clarify the pathogen species of soft rot of Phalaenopsis in Zhejiang Province and the difference in disease resistance of different Phalaenopsis varieties， the pathogen of Phalaenopsis soft rot was isolated and identified by the morphology， physiological and biochemical characteristics of bacteria and phylogenetic analysis. The resistance of different Phalaenopsis varieties to soft rot was evaluated by in vitro leaf inoculation method. The results showed that： 1） The pathogenic of Phalaenopsis soft rot were Gram-negative bacteria. The colonies were milky white round or nearly round on nutrient agar （NA） medium （without glucose）， and the colonies were light purple on nutrient glycerol manganese （NGM） medium. The single bacterium was observed to be rod-shaped. 2） Based on 16S rRNA， dnaX， gapA and recA genes， a multi-gene phylogenetic tree was constructed， and the analysis showed that strain B belongs to the same branch as Dickeya fangzhongdai B16. 3） The resistance of 40 Phalaenopsis varieties to soft rot in vitro was evaluated. It was discovered that there are 1 high resistant variety ‘ES L20’， 1 resistant variety， 14 moderately resistant varieties， 18 susceptible varieties and 6 highly susceptible varieties were identified. In this study， the pathogen causing soft rot of Phalaenopsis in Zhejiang Province was identified， and the resistance information of some Phalaenopsis varieties was provided. This study laid a foundation for further research on the characteristics of disease occurrence and prevention methods and breeding disease-resistant varieties.

Graphical abstract

关键词

蝴蝶兰 / 软腐病 / 病原鉴定 / Dickeyafangzhongdai / 抗性评价

Key words

Phalaenopsis / soft rot / pathogen identification / Dickeya fangzhongdai / resistance evaluation

蝴蝶兰为兰科、蝴蝶兰属多年生草本植物，原产于中国台湾、泰国和菲律宾等地区，花序形态优美、颜色艳丽，具有极高的观赏价值，长期居于欧洲、日本盆花销售量的榜首^［1］，是目前国际市场上最受欢迎的热带兰之一，被誉为“洋兰皇后”。随着蝴蝶兰生产规模快速扩大，病害问题日益凸显，其中，蝴蝶兰软腐病被称为危害蝴蝶兰生产的“头号杀手”，是目前产业化栽培中最为严重的病害之一。该病在一年四季均可发生，尤其以夏秋两季最为严重，并且传染性极强，在高温高湿条件下蔓延极快，数天内即可导致整株植株腐烂死亡，给蝴蝶兰生产带来巨大经济损失^［2］。喷施农药是目前生产上预防蝴蝶兰软腐病的主要措施，但病菌一旦侵入后，一般农药无法抑制病斑的扩展，而且喷施农药会增加生产成本，导致病原抗药性及环境污染等问题。因此，开展蝴蝶兰软腐病抗性研究，培育抗性品种是防控该病害最经济、有效的策略。

虽然研究发现泛菌属（Pantoea）、假单胞菌属（Pseudomonas）、噬酸菌属（Acidovorax）和伯克氏菌属（Burkholderia）能够导致一些观赏植物软腐病^［3］，如褚晓玲等^［4］对武汉地区蝴蝶兰软腐病病原菌进行分离，结合生理生化与分子生物学鉴定为Pseudomonas grimontii；肖爱萍等^［5］对广东省蝴蝶兰软腐病病原菌进行鉴定，结果为Burkholderia cepacia。但目前普遍认为引起园艺作物软腐病的致病菌主要为果胶杆菌属（Pectobacterium）和迪基氏菌属（Dickeya），该两属目前均被列为植物十大病原菌属之一^［6］。例如普遍引起白菜和黄瓜等蔬菜软腐病^［7］的Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum；Alič等^［8］对斯洛文尼亚蝴蝶兰软腐病病原进行全基因组测序，结果表明致病菌为Dickeyafangzhongdai，这是该菌在全球范围内引起蝴蝶兰软腐病的首次报道；Fu等^［9］和Sudarsono等^［10］认为引起台湾地区和印度尼西亚蝴蝶兰细菌性软腐病的病原菌为Erwinia chrysanthemi；2010年吴志毅等^［11］对杭州地区蝴蝶兰软腐病菌进行了分离鉴定，结果同为菊欧文氏菌，与国外报道一致。但由于该菌分类产生较大变化，常造成一些文献的引用混乱。P. grimontii、B. cepacia、E. chrysanthemi、D. fangzhongdai和D. dadantii subsp. dieffenbachiae^［12］均有记载能导致蝴蝶兰软腐病的发生，且由于迪基氏菌属、果胶杆菌属及欧文氏菌属分类及命名变化较为频繁，及时准确识别是哪一种病菌引起目前浙江地区蝴蝶兰软腐病的发生非常必要。同时，导致软腐病的病原在不同地区也有所不同，因此重新对浙江地区蝴蝶兰软腐病病原菌进行鉴定有着重要意义，可为各地区蝴蝶兰软腐病的防治提供科学依据。

抗病性鉴定是评价植物品种、品系或种质对特定病害的抵抗或感染程度，是抗病育种不可或缺的基础研究，从抗源筛选、后代选择，到品种推广的整个过程都离不开抗病性鉴定^［13］。蝴蝶兰作为浙江省主要盆栽花卉，在销售旺季经常出现供不应求的情况，而软腐病是蝴蝶兰产业发展面临的阻力之一。由于抗软腐病品种资源非常有限，抗病育种的进程相对缓慢。因此，本研究对浙江地区蝴蝶兰软腐病进行分离、鉴定，并对40个蝴蝶兰品种进行抗软腐病评价，以期为病害防控、抗病品种的选育及利用提供研究基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料

选取位于杭州市西湖区的百盛精准农业有限公司种苗基地与位于湖州市德清县的德清天地农林科技有限公司种苗基地发现的蝴蝶兰软腐病典型病株共5株，致病性试验所用蝴蝶兰品种为‘玲珑’‘白天鹅’‘勃艮第’‘第一名’‘小女孩’‘小可爱’，40个供试蝴蝶兰品种种植在浙江农林大学平山试验基地。所有测试植株苗龄为12个月，均未抽梗。

1.2　试验方法

1.2.1　病原菌的分离、纯化

剪取病叶，放入无菌组培瓶中，在瓶口套上纱布，用清水连续冲洗20 min；将叶片病健交界处切成5 mm×5 mm的组织块并在75%酒精溶液中连续震荡30 s，迅速用无菌水冲洗干净；将组织块放入3%次氯酸钠溶液中消毒2 min，无菌水冲洗3次；将组织块表皮撕开，放置营养琼脂（NA）平板上28 ℃暗培养2 d；用平板划线法将组织块周围生长的细菌纯化3次后，用营养肉汤（NB）培养液进行培养，配制成甘油终浓度为25%的甘油菌液混合物，-80 ℃保存菌株。

1.2.2　柯赫氏法则验证及致病性测定

采用活体针刺接种法进行柯赫氏法则（Koch’s postulates）验证，若发病则分离病菌，配制浓度为1×10⁸ CFU/mL的菌悬液。将菌悬液回接至上述6个品种的由上至下第二真叶中脉两侧，用无菌接种针刺破叶片表皮，吸取0.5 μL菌液接种至叶肉组织伤口上。每个叶片共4个接种点，中脉左侧接种菌悬液，右侧接种NB培养液，及时观察发病情况和症状，并在接种24 h后记录病斑大小。

1.2.3　致病菌形态观察及生理生化鉴定

观察纯化后的菌落颜色、形态等特征，使用营养琼脂甘油锰（NGM）培养基对致病菌进行培养，观察菌体表面有无浅紫色产生^［14］；采用湖南比克曼生物科技有限公司的革兰氏染色试剂盒进行染色。

使用杭州微生物试剂有限公司的细菌生化鉴定管对致病菌进行半固体琼脂（运动性）试验、乙酰甲基甲醇（V-P）试验、甲基红（MR）试验、尿素分解、硫化氢产生及各类糖（醇）利用等细菌生理生化特性研究。

1.2.4　致病菌分子鉴定

收集菌体，采用CTAB法^［15］提取致病菌总基因组DNA。所需引物见表1，引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成，利用27F/1492R通用引物对致病菌基因组的16S rRNA基因序列进行PCR扩增。PCR反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL、27F 2 μL、1492R 2 μL、DNA 2 μL、ddH₂O 19 μL，共计50 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸100 s，35个循环；72 ℃终延伸8 min。通过查阅文献，选取dnaX、recA和gapA基因作进一步鉴定，PCR反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 37.5 μL、正向引物3 μL、反向引物3 μL、DNA 3 μL、ddH₂O 28.5 μL，共计75 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，30个循环；72 ℃终延伸5 min。

PCR产物在1×TAE中进行1%琼脂糖凝胶电泳验证。将含有目的条带的凝胶回收，连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌感受态细胞进行抗性筛选，挑取阳性菌落经菌检后送至北京擎科生物科技股份有限公司杭州分公司测序。对测序结果用BLAST程序与GenBank数据库中已知序列进行比对和同源性分析，将序列按照16S rRNA-dnaX-gapA-recA顺序拼接，采用贝叶斯法（MrBayes）构建多基因联合系统发育树，设置generations为5 000 000。

1.2.5　抗病性评价

通过预试验发现接种致病菌6 h后，接种点周围出现小规模水渍状病斑。在接种24 h后部分品种病斑即将扩散至叶片边缘，此时不同品种的病斑大小能够体现出抗病差异，因此选用致病菌侵染24 h作为抗病性评价病斑面积计算时间。

用NB培养液配制1×10⁸ CFU/mL的菌悬液，并用无菌水将拟接种叶片擦拭干净，剪取合适大小；在培养皿中放2张无菌滤纸，吸取2 mL无菌水将滤纸均匀打湿；将剪取的叶片放入培养皿中，轻轻刺破叶片表皮，吸取0.5 μL菌液打至伤口表面，对照处理接种NB培养液；将培养皿密封后放置光照培养箱中培养。设置昼/夜温度29 ℃/26 ℃、相对湿度85%，先黑暗培养10 h，再光照培养14 h，在接种后0、6、12和24 h对病斑进行拍照记录。每株叶片接种点位于由上至下第二真叶中脉两侧，取发病后2个病斑的平均面积作为该株病斑面积分级标准取值。每个品种接种10株，3次生物学重复。

由于采用蝴蝶兰离体叶片进行针刺接种，且不同品种叶片大小差异较大，因此不适宜使用病斑面积与叶片总面积比值法作为分级标准。参考马燕勤等^［19］的病情分级标准，结合蝴蝶兰软腐病病斑实际情况稍加改动，建立了病斑面积分级法标准。分级标准如下：0级：无水渍状病斑；1级：0 cm²<病斑总面积≤1.5 cm²；2级：1.5 cm²<病斑总面积≤3 cm²；3级：3 cm²<病斑总面积≤4.5 cm²；4级：4.5 cm²<病斑总面积≤6 cm²；5级：病斑总面积>6 cm²。

接种点发病率=（发病接种点/总接种点）×100%（1）

病情指数（Disease index，DI）=∑（各级发病株数×该级代表值）/（总株数×最高病级代表值）×100^［20］（2）

蝴蝶兰品种抗性划分^{［19，21］}见表2。

1.3　数据分析

使用ImageJ 1.53k软件计算病斑面积，利用PhyloSuite软件构建多基因联合系统发育树，采用Microsoft Excel 2016软件统计和分析数据，应用SPSS 26.0软件对试验数据进行单因素方差分析，使用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2　结果与分析

2.1　病害症状

蝴蝶兰软腐病可发生在植株叶片和根茎部位。初期为水渍状斑点，在光源照射下表现透明状，随后在高温高湿环境下迅速扩大，整个叶片内部形成浸渍，但仍被叶片蜡质层与角质层所包裹（图1（a））。当病斑扩散到一定程度时，原先感染区域变为褐色坏死组织（图1（b）），在溃烂后发出恶臭（图1（c））。同时，病斑会迅速蔓延到其他部位（图1（d）），导致整株蝴蝶兰腐烂并死亡。

2.2　柯赫氏法则验证与致病力测定

经柯赫氏法则验证，分离并纯化后的菌株B可导致蝴蝶兰软腐病的发生，并与采集的软腐病病株症状相同，形成水渍状病斑并逐渐褐化。‘玲珑’‘白天鹅’‘勃艮第’‘第一名’‘小女孩’‘小可爱’品种接种菌株B 24 h后的病斑表型如图2所示，中脉左侧为接种后的软腐病斑，右侧对照均未发病，由此判定菌株B为浙江地区蝴蝶兰软腐病的致病菌。

2.3　形态学观察

将致病菌接种至NA培养基，28 ℃黑暗培养36 h，菌株B在培养基形成乳白色、表面光滑、圆形或近圆形的单菌落（图3（b）），伴有刺激性气味；革兰氏染色结果呈示菌株B为阴性菌。在NGM培养基上，菌体表面呈浅紫色（图3（c）），根据Lee等^［14］初步判定菌株B为迪基氏菌属；在100倍油镜下菌株B单菌呈杆状（图3（d））。

2.4　生理生化鉴定

生理生化试验结果表明（表3），菌株B具备在39 ℃生长的能力，具有运动性，能够分解蛋白胨生成吲哚；不能分解半胱氨酸产生硫化氢，不能产生苯丙氨酸脱氨酶，不能氧化葡萄糖酸盐，不能分解尿素，在MR试验和V-P试验中显示阴性。菌株B可以利用枸橼酸盐、棉子糖、木糖、蔗糖和甘露醇，不能利用赖氨酸、鸟氨酸、山梨醇和侧金盏花醇。

2.5　分子生物学鉴定

以菌株B基因组DNA为模板，使用引物对27F/1492R扩增16S rRNA基因序列，获得1 504 bp基因片段。将测序所获序列上传至GenBank，登录号为OQ804352。通过与Genbank的数据库进行BLAST比对，结果显示测序序列与GenBank中D. fangzhongdai和D. chrysanthemi的相似性均高达99%以上，结合形态学观察确定致病菌属于迪基氏菌属。由于16S rRNA基因在Dickeya属内近缘种间的差异性较小，因此对菌株B作深层次的dnaX、recA和gapA持家基因分子鉴定。使用引物dnaXf/dnaXr、recAf/recAr和gapAf/gapAr扩增3个基因序列，分别获得536、737和932 bp基因片段。不同基因序列通过BLAST比对，结果表明菌株B与标准菌株D. fangzhongdai DSM 101947相似性最高，均达到99.5%以上。将序列按16S rRNA、dnaX、gapA和recA顺序拼接并构建多基因联合系统发育树，结果显示菌株B与菌株D. fangzhongdai B16属于同一分支（图4），由此确定引起浙江省蝴蝶兰软腐病的致病菌为D. fangzhongdai。

2.6　抗病性评价

对40个蝴蝶兰品种进行离体叶片抗软腐病评价，结果表明不同品种对软腐病菌抗性存在较大差异，部分品种接种软腐病菌后不同时间病斑表型图如图5所示，对照处理均未发病。40个品种共800个接种点，发病接种点为756个，占接种点总数的94.5%；对照接种点均未发病。共得到5个抗性分类级别，分别为：高抗品种1个，占比2.5%；抗病品种1个，占比2.5%；中抗品种14个，占比35%；感病品种18个，占比45%；高感品种6个，占比15%。通过观察发现不同抗病性级别的品种在接种后12~24 h病斑面积增长幅度最大。高抗品种‘ES L20’在测试的20个接种点中有16个接种点病斑面积为0，其余病斑面积则极小，接种点发病率为20%，病情指数为8.33，平均病斑面积仅为0.47 cm²。抗病品种‘椪柑’接种点发病率为80%，病情指数40.00，平均病斑面积为2.33 cm²。6个高感品种分别为‘紫水晶’‘巨无霸’‘红梅’‘缇娜3#’‘P. Sogo Chabstic’‘勃艮第’，这6个高感品种发病率均高于95%，形成的病斑以接种点为中心，扩散至叶片边缘。病情指数最大的品种为‘紫水晶’，达到93.33，该品种发病率100%，平均病斑面积为6.88 cm²（表4）。

3　讨论

近年来，16S rRNA基因序列分析已经成为细菌分类鉴定中的常用方法^［22］，不过由于16S rRNA基因存在多拷贝及高度保守的特点，单独利用其对某些细菌进行分类研究存在局限性。相比之下，dnaX^［16］、recA^［17］和gapA^［18］基因作为单拷贝持家基因，普遍存在于各种细菌中并且不发生水平转移，因此在区分和鉴定细菌近缘种时，将其与16S rRNA基因序列进行拼接并构建多基因联合系统发育树具有更高的分辨率。

软腐病是目前兰科花卉产业最具破坏性的病害之一，其病原主要为迪基氏菌属及果胶杆菌属。本研究从5株浙江不同地区受软腐病菌侵染的蝴蝶兰叶片中分离出一种病原菌，依据柯赫氏法则验证与致病性测定，分别接种分离的病原菌于6个品种的健康蝴蝶兰叶片，对应叶片均发病，且再次分离纯化出相应的病原菌，经形态学观察、生理生化特性研究和分子生物学鉴定，结果表明病原菌为D. fangzhongdai。该菌隶属的迪基氏属细菌能对多种作物引起腐烂性病害，如香蕉、玉米、马铃薯、番茄和梨树等^［23］，是目前导致植物病害最严重的10种植物病原菌属之一^［6］。D. fangzhongdai是2016年从梨树锈水病中分离并结合多基因联合发育分析、全基因组平均核苷酸同源性分析等鉴定的新种^［24］，是迪基氏菌属唯一能引起乔木植物病害的病原，在基因组上与D. dadantii、D. dianthicola和D. solani分支接近。D. fangzhongdai的寄主广泛，具有较强致病能力，能够引起多种园艺作物软腐病害，如半夏^［25］、大葱^［26］、魔芋^［27］和香芋^［28］等，其侵染部位普遍以叶片为主，在高温高湿条件下迅速扩散，从而导致全株腐烂，造成巨大经济损失。同时，该菌在全球范围内已普遍引起蝴蝶兰、文心兰和卡特兰等兰科花卉软腐病。Zhang等^［29］在2018年对广东省蝴蝶兰软腐病菌进行全基因组测序，结果证实致病菌为D. fangzhongdai，这是该菌在国内引起蝴蝶兰软腐病的首次报道。有研究发现^［30］，D. fangzhongdai部分菌株可在水中长时间存活并已被成功分离，因此在蝴蝶兰栽培管理过程中应注重灌溉水质和环境，在发现有病株存在时需及时隔离处理，避免浇灌时水源受病菌交叉污染。由于不同地区蝴蝶兰软腐病病原有所不同，本研究鉴定出一种导致浙江地区蝴蝶兰软腐病的病原菌，可为当地今后的软腐病病害防控提供重要的理论支撑。

人工接种进行抗病性评价是筛选抗软腐病品种的一种重要方式。离体接种鉴定作为人工接种方法的一种，具有准确、快速、筛选量大和受外界环境条件影响较小等优点，已广泛应用于大白菜、甜瓜和西瓜等园艺作物的病害抗性鉴定^［31］。本研究前期预试验发现直接在蝴蝶兰叶片表面涂抹菌液或利用无菌棉吸取菌液敷在叶片表面难以发病，说明软腐病菌主要依靠伤口进行侵染，这与沈会芳等^［32］的研究结果相似，故本研究采用针刺法进行接种。目前国内对蝴蝶兰软腐病的研究主要集中于致病菌的分离和鉴定，而在不同蝴蝶兰品种抗软腐病评价方面的研究相对较少。本研究通过离体叶片结合针刺接种的方法，对40个蝴蝶兰品种进行了抗病性评价，结果显示大部分品种为感病或中抗型；‘ES L20’对软腐病菌表现出较高的抗性，超过市场上常见的品种，有望在育种工作中作为蝴蝶兰抗软腐病的亲本，进行定向育种。目前‘ES L20’品种抗软腐病菌侵染的主要机制尚未清楚，因此，未来有必要进一步探究其抗软腐病的分子机理，挖掘相关抗性基因，从而为科学防治软腐病和蝴蝶兰抗软腐病育种研究奠定基础。

4　结论

本研究采用组织分离法对浙江地区蝴蝶兰软腐病病株进行致病菌分离与纯化，并通过柯赫氏法则验证，结合形态学观察、细菌生理生化特性研究与多基因联合系统发育分析，发现一种引起浙江地区蝴蝶兰细菌性软腐病的病原菌为D. fangzhongdai。利用病原菌株B对40个蝴蝶兰品种进行抗软腐病评价，鉴定出1个高抗品种（‘ES L20’）、1个抗病品种、14个中抗品种、18个感病品种和6个高感品种。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(32201610)

浙江省农业新品种重大专项花卉育种专项(2021C02071-5)

浙江省“尖兵”“领雁”研发攻关计划项目(2023C02028)