基于mtDNA D-loop序列分析青海省果洛州牦牛遗传资源的母系遗传多样性及群体遗传结构

Exploring maternal genetic diversity and population genetic structure of yak genetic resources in Golog Prefecture, Qinghai, China based on mtDNA D-loop sequence variations

摘要

为从分子水平上对青海省果洛藏族自治州牦牛遗传资源进行系统评估，分析其母系遗传多样性、群体遗传结构和群体遗传分化，本研究对甘德、班玛、久治和玛多牦牛群体共152头个体进行线粒体DNA（mtDNA）D-loop区测序，并从GenBank下载已公布的37条达日牦牛和32条玛沁牦牛的相应序列，对这6个牦牛群体mtDNA D-loop序列进行综合分析。结果表明：1）221条牦牛mtDNA D-loop序列（636~638 bp）比对分析共检测出57个变异位点，包括8个单一多态位点和49个简约信息位点。根据D-loop序列间核苷酸变异共确定了45种单倍型，其中班玛、达日、甘德、久治、玛多、玛沁牦牛群体分别拥有1、6、5、4、7、6种特有单倍型。2）6个牦牛群体总的单倍型多样度和核苷酸多样度为0.901和0.014，表明其母系遗传多样性丰富。其中，甘德牦牛的单倍型多样度最高（Hd=0.951），久治牦牛的单倍型多样度最低（Hd=0.818）。3）遗传分化和基因流分析表明，除久治牦牛与班玛、甘德、玛沁牦牛群体间分化程度均呈中等遗传分化水平（0.05≤F_ST<0.15），基因交流相对贫乏外，其他牦牛群体间F_ST值较小（0<F_ST<0.05），分化程度弱，基因交流相对频繁。4）聚类分析表明久治、甘德、班玛3个牦牛群体间亲缘关系较近，而玛多、玛沁、达日3个牦牛群体间亲缘关系较近。5）系统发育分析显示6个牦牛群体中除久治牦牛由3个母系遗传支系（即Mt-Ⅰ、Mt-Ⅱ和Mt-Ⅲ）组成外，其他群体均由Mt-Ⅰ和Mt-Ⅱ 2个母系支系组成，推测果洛藏族自治州中久治牦牛群体有3个母系起源，其他牦牛群体均有2个母系起源。综上，青海省果洛藏族自治州6个牦牛群体均拥有特殊的母系遗传信息且母系遗传多样性较为丰富；各牦牛群体间遗传分化程度整体较弱；久治、甘德和班玛3个牦牛群体间亲缘关系较近，而玛多、玛沁和达日3个牦牛群体间亲缘关系较近；除久治牦牛群体有3个母系起源外，其他牦牛群体均有2个母系起源。本研究为青海省果洛藏族自治州牦牛遗传资源的合理保护和开发利用提供了理论基础。

Abstract

To systematically evaluate the maternal genetic diversity， population genetic structure and population genetic differentiation of the yak genetic resources in Golog Tibetan Autonomous Prefecture of Qinghai Province， China at the molecular level， a total of 152 yaks from Gande， Banma， Jiuzhi， and Maduo Counties were collected and the corresponding mtDNA D-loop sequences were sequenced. The six yak populations were comprehensively analyzed after downloading 37 and 32 reported mtDNA D-loop sequences of Dari and Maqin yak populations from Genbank. The results showed that： 1） 57 polymorphic sites were detected in 221 mtDNA D-loop （636- 638 bp） sequences of six yak populations， including 8 single polymorphic sites and 49 parsimony informative sites. A total of 45 haplotypes were identified based on nucleotide variations， among which 1， 6， 5， 4， 7， 6 specific haplotypes were detected in Banma， Dari， Gande， Jiuzhi， Maduo， and Maqin yak populations， respectively. 2）The haplotype diversity and nucleotide diversity of the six yak populations were 0.901 and 0.014， indicating abundant maternal genetic diversity in these yak populations. Among them， the highest haplotype diversity was found in the Gande yak population （Hd=0.951） and the lowest in the Jiuzhi yak population （Hd=0.818）. 3）Analysis of genetic differentiation and gene flow showed moderate genetic differentiation （0.05≤F_ST<0.15） and poor gene exchange between Jiuzhi yak population and Banma， Gande， and Maqin yak populations respectively. However， the F_ST values among other yak populations were lower （0<F_ST<0.05） and had a low genetic differentiation， indicating gene exchange was relatively frequent. 4）The clustering of Jiuzhi， Gande， and Banma yak populations was closer， while the clustering of Maduo， Maqin， and Dari yak populations was also closer. 5）Phylogenetic analysis showed that among the six yak populations， except for the Jiuzhi yak population， which was composed of three maternal lineages （i.e.， Mt-Ⅰ， Mt-Ⅱ， and Mt-Ⅲ）， the other yak populations were composed of two maternal lineages （Mt-Ⅰ and Mt-Ⅱ）. It was speculated that Jiuzhi yak population has three maternal origins， and the other yak populations have two maternal origins. In summary， the six yak populations in Golog Tibetan Autonomous Prefecture all had unique maternal genetic information and relatively rich maternal genetic diversity. The overall genetic differentiation among the 6 yak populations was very weak. The clustering of Jiuzhi， Gande， and Banma yak populations was closer， while the clustering of Maduo， Maqin， and Dari yak populations was closer. Except for the Jiuzhi yak population with three maternal origins， the other yak populations had two maternal origins. This study will provide a theoretical basis for further reasonable protection， development， and utilization of yak genetic resources in Golog Tibetan Autonomous Prefecture of Qinghai Province.

Graphical abstract

关键词

牦牛 / mtDNA D-loop区 / 遗传多样性 / 遗传分化 / 群体结构 / 系统发育

Key words

yak / mtDNA D-loop region / genetic diversity / genetic differentiation / population structure / phylogeny

牦牛对青藏高原高海拔、强紫外线、严寒等恶劣环境的适应性很强，有“高原之舟”的美称^［1］。青海省牦牛驯养历史悠久，全省现有牦牛约500多万头，主要分布在牧区6个州（即黄南藏族自治州、果洛藏族自治州、玉树藏族自治州、海南藏族自治州、海北藏族自治州和海西蒙古族藏族自治州），养殖数量居全国首位，是全国最大的有机牦牛肉、乳生产基地^［2］。果洛藏族自治州海拔在4 000~5 000 m，自西北向东南倾斜，地形平缓，坡陡谷深，其境内属典型的高原大陆性气候，具有高寒缺氧、气温低、光辐射强、昼夜温差大、日照时间长、降雨（雪）量较多、蒸发量大、多阵性大风等特点。牦牛既是牧民赖以生存的物质基础，也是推动牧区经济可持续发展的支柱产业和牧民稳定增收的主要来源。果洛藏族自治州下辖6个县（即达日、玛沁、甘德、班玛、久治和玛多县），是牦牛传统养殖主产区，2020年牦牛存栏数274万头，占全省牦牛总数的45%以上^［3］。

线粒体DNA （Mitochondrial DNA， mtDNA）具有母系遗传、不易发生重组且突变率高等特点，被认为是探究物种系统发育、聚类关系和遗传多样性状况的理想遗传标记之一^［4-5］。与mtDNA其他序列区域相比，D-loop区具有更丰富的多态性和更快的突变速率。因此，D-loop区被广泛应用于揭示牦牛的群体遗传结构、母系遗传多样性和系统发育关系^［5-6］。先前的研究者已利用mtDNA D-loop序列和部分蛋白编码基因变异揭示了野牦牛和我国6个牦牛产区的多个家牦牛品种（群体）的母系遗传多样性。多项研究表明我国多数牦牛品种（群体）具有较为丰富的母系遗传多样性，由2个母系支系组成，仅格尔木牦牛群体由3个母系支系组成^［7-14］。然而，Wang等^［15］、Wang等^［16］、李广祯等^［17］和Ma等^［18］基于mtDNA D-loop序列和mtDNA全序列对野牦牛和家牦牛品种（群体）的分析表明，野牦牛和部分家牦牛品种（群体）拥有丰富的母系遗传多样性，但发现雪多牦牛和野牦牛群体中少量个体存在于第3个母系分支中，故推测牦牛有3个母系起源。

当前，在对青海省果洛藏族自治州牦牛遗传资源的研究中，仅白诗睿等^［19］对达日、玛沁、岗龙（甘德）3个牦牛群体的mtDNA D-loop序列进行了测定分析，表明岗龙（甘德）、达日牦牛群体的母系遗传多样性水平高于玛沁牦牛群体，3个群体均由2个母系支系组成，故推测其有2个母系起源。虽然先前的研究者已对该州的部分牦牛群体（如达日、玛沁、岗龙（甘德））进行了母系遗传研究报道，但目前尚无对青海省果洛藏族自治州下辖6个县所有牦牛遗传资源的母系遗传系统分析。鉴于此，本研究基于mtDNA D-loop序列对青海省果洛藏族自治州6个牦牛群体（即达日、玛沁、甘德、玛多、久治、班玛牦牛）进行综合分析，探究其母系遗传多样性水平、群体遗传结构和母系遗传背景，为果洛藏族自治州牦牛遗传资源的分子评估提供基础材料，进而为青海省乃至我国牦牛遗传资源的合理保护和开发利用奠定基础。

1　材料与方法

1.1　样品采集、基因组DNA提取及序列下载

为使采集的样品具有代表性，在青海省果洛藏族自治州各县进行实地调查、询问牧户有关牦牛群体的养殖历史，同时查阅牦牛相关谱系记录，采用随机采样法在甘德县（33份）、班玛县（32份）、久治县（44份）和玛多县（43份）共采集152份牦牛颈静脉血样，各群体采样点地理分布见图1，ACD抗凝后带回实验室保存备用。使用全血基因组DNA提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取基因组DNA，对DNA浓度和纯度进行双重检测，当样品的浓度大于100 ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值介于1.7~1.9时，提示所提取的基因组DNA质量满足后续使用，将提取的基因组DNA浓度稀释至50~100 ng/μL，-20 ℃保存备用。同时，从GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中分别下载已报道的果洛藏族自治州达日县和玛沁县牦牛群体的37条（GenBank No.：DQ138998-DQ139034）^［20］和32条（GenBank No.：DQ139043-DQ139074）^［20］ mtDNA D-loop序列，结合本试验中测定的152条相应序列，对共计221条序列进行综合分析。

1.2　PCR扩增与测序

参照先前牦牛的母系遗传研究报道^［18］，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成mtDNA D-loop区序列扩增引物（上游引物F： 5'-GTAAAGAGCCTCACCAGTAT-3'；下游引物R： 5'-TCCTCTAGCCATTGACTAT-3'）来扩增各牦牛群体的mtDNA D-loop区。PCR扩增在25 µL反应体系中进行，包括上、下游引物各1 µL、超纯水9.5 µL、基因组DNA 1 µL、2×Premix 12.5 µL。PCR程序包括95 ℃预变性4 min，35个循环（95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延长5 min，最后4 ℃冷却保存，后送PCR纯化产物至北京擎科生物科技有限公司进行双向测序获得测序结果。

1.3　数据分析

对青海省果洛藏族自治州6个牦牛群体共221条序列使用BioEdit7.2.5软件^［21］进行人工校对和多序列比对分析，统计序列长度和多态位点。

使用DnaSP5.10软件^［22］确定6个牦牛群体的单倍型（组）数目和类型。

利用Arlequin3.11软件^［23］计算群体单倍型多样度和核苷酸多样度，通过与其他牦牛品种（群体）相应的多样性指数值大小进行比较，以揭示6个牦牛群体的遗传多样性水平。基于固定分化指数（F_ST）和基因流（N_m ）值大小揭示6个牦牛群体间的分化状况，群体间F_ST和N_m 值大小满足以下等式：N_m =（1-F_ST）/（4F_ST） ^［24］。R_ST值通过线性化的F_ST值计算所得，满足以下等式：R_ST=F_ST/（1-F_ST）^［25］。

用MEGA5.05软件^［26］基于R_ST值来构建UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean， UPGMA）树状图以揭示6个牦牛群体间的遗传关系。

采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）用MEGA 5.05软件^［26］构建系统发育树及Network10.1软件^［27］构建网络中介图（Median-Joining， MJ）探究6个牦牛群体单倍型（组）间的系统发育关系来揭示其群体结构组成和母系遗传背景。

2　结果与分析

2.1　果洛藏族自治州6个牦牛群体母系遗传多样性分析

对青海省果洛藏族自治州6个牦牛群体mtDNA D-loop序列（636~638 bp）进行比对分析，排除2处插入（缺失）位点后，共检测到57处多态位点（图2），包括8处单一多态位点和49处简约信息位点。在班玛、达日、甘德、久治、玛多和玛沁牦牛群体中分别检测到33、38、36、41、38和36个变异位点。根据序列间的遗传变异，共确定了45种单倍型，单倍型序列已提交NCBI数据库，登录号（GenBank No.）为：PP077356-PP077400。在班玛、达日、甘德、久治、玛多和玛沁牦牛群体中分别确定了11、17、18、11、18和13种单倍型，而各自拥有特有单倍型1、6、5、4、7和6种（表1、表2和图2）。其中，H1、H2、H6和H7 4种单倍型为优势单倍型，均被6个牦牛群体共享，分别由18、25、17和57个个体（序列）所拥有；同时，有21种单倍型均由不同牦牛群体的1个个体（序列）所拥有，为稀有单倍型。参考先前的研究报道^{［18，20］}，对6个牦牛群体的线粒体D-Loop单倍型序列进行单倍型组类型确定及分布分析（表2）。结果表明，6个牦牛群体的221个个体（序列）分布在A、B、C、D、E和G共6种单倍型组中，所占比例分别为63.35%（140/221）、13.57%（30/221）、5.43%（12/221）、10.41%（23/221）、5.88%（13/221）和1.36%（3/221），其中A、B和D 3种单倍型组被6个牦牛群体所共享，而C单倍型组被除班玛、玛沁牦牛外的其他4个牦牛群体共享，E单倍型组被除久治牦牛以外的5个牦牛群体共享，G单倍型组只被久治牦牛群体所拥有。

遗传多样性指数计算结果如表1所示，6个牦牛群体总的单倍型多样度为0.901，核苷酸多样度为0.014。甘德（Hd=0.951）、达日（Hd=0.901）牦牛群体的单倍型多样度高于班玛（Hd=0.897）、玛沁（Hd=0.887）、玛多（Hd=0.876）、久治（Hd=0.818）牦牛群体的单倍型多样度，而班玛、玛沁和玛多牦牛群体的单倍型多样度也相对较高，相比而言久治牦牛群体具有较低的单倍型多样度（表1）。与此同时，将本研究6个牦牛群体多样度指数值大小与先前报道的野牦牛及17个我国其他家牦牛品种相应的多样性指数值相比（表1和表3），可以看出，青海省果洛州6个牦牛群体多样度值均较高。

2.2　果洛藏族自治州6个牦牛群体间遗传分化分析

为揭示牦牛群体间的母系遗传分化情况，本研究计算了6个牦牛群体间的固定分化指数值（F_ST）和基因流（N_m ）大小（表4），结果表明：果洛州6个牦牛群体F_ST值为-0.006~0.072，久治牦牛群体与班玛、甘德和玛沁牦牛群体间为中等以上程度的遗传分化（0.05≤F_ST<0.15），而其他牦牛群体间F_ST值较小（F_ST<0.05），分化程度不显著。6个牦牛群体N_m 的范围为3.222~124.750，久治牦牛群体与玛沁牦牛群体间基因流值最小（3.222），班玛牦牛群体与达日、玛多牦牛群体间以及达日牦牛与玛多牦牛群体间基因流值均较高（124.750）。

利用群体间R_ST值构建UPGMA树（图3），结果显示6个牦牛群体明显地聚为2类：甘德牦牛与久治牦牛最先聚在一起，再与班玛牦牛聚为一类；而玛多牦牛与玛沁牦牛最先聚在一起，后与达日牦牛聚为另一类。

2.3　果洛藏族自治州6个牦牛群体系统发育分析

从GenBank中下载美洲野牛（Bison bison）的mtDNA D-loop序列（GenBank No.：EU177871）作为外群，以已报道的牦牛母系遗传研究中3个母系支系所包含的不同单倍型组序列作为参考序列^［18］，即支系Ⅰ（包括A、B、E单倍型组，代表序列分别为FJ548844、GQ414640、GQ464132），支系Ⅱ（包括C、D单倍型组，代表序列分别为FJ548843、FJ548840）和支系Ⅲ（包括G单倍型组，代表序列为DQ139202），对6个牦牛群体确定的mtDNA D-loop单倍型构建系统发育树（图4）。结果表明：45种单倍型分布在A、B、C、D、E和G共6种单倍型组中，分别占55.56%（25/45）、15.56%（7/45）、11.11%（5/45）、11.11%（5/45）、4.44%（2/45）和2.22%（1/45）。其中，A单倍型组包含25种单倍型（即H2、H5、H7、H9、H10、H11、H13、H15、H16、H17、H19、H21、H23、H24、H25、H27、H28、H30、H32、H36、H37、H38、H40、H41和H43），B单倍型组包含7种单倍型（即H1、H3、H4、H12、H22、H35和H45），C单倍型组包含5种单倍型（即H14、H26、H29、H34和H39），D单倍型组包含5种单倍型（即H6、H18、H20、H42和H44），E单倍型组包括2种单倍型（即H8和H33），而G单倍型组包括1种单倍型（即H31）。45种单倍型明显的聚为3个大的母系支系（即Mt-Ⅰ、Mt-Ⅱ和Mt-Ⅲ），其中Mt-Ⅰ支系包含A、B和E 3种单倍型组，由34种单倍型的183个个体（序列）所拥有，占比为75.56%（34/45）；Mt-Ⅱ支系包括C和D 2种单倍型组，由10种单倍型的35个个体（序列）所拥有，占比为22.22%（10/45）；而Mt-Ⅲ支系仅包括G单倍型组一种，由1种单倍型的3个个体（序列）拥有，占比为2.22%（1/45）。与此同时，班玛、玛沁牦牛群体的单倍型个体存在于A、B、D和E 4种单倍型组中，达日、甘德和玛多牦牛群体的单倍型个体属于A、B、C、D和E 5种单倍型组，而久治牦牛的单倍型个体属于 A、B、C、D和G 5种单倍型组。值得注意的是，G单倍型组只存在于久治牦牛群体中。

3　讨 论

家畜的遗传多样性研究有助于了解其所蕴含的特殊遗传信息，对进一步开展其遗传资源的客观评估、发掘、保护和开发利用具有重要意义。在本研究中，基于mtDNA D-loop对青海省果洛藏族自治州的6个牦牛群体进行母系遗传分析，确定了45种单倍型，发现班玛、达日、甘德、久治、玛多和玛沁牦牛中分别拥有1、6、5、4、7和6种特有单倍型，说明这6个牦牛群体均拥有特殊的母系遗传信息。6个牦牛群体总的单倍型多样度为0.901，核苷酸多样度为0.014，提示这6个牦牛群体拥有较为丰富的母系遗传多样性。先前家牦牛品种（群体）（Hd=0.621~1.000）和野牦牛群体（Hd=0.957~0.967）的研究发现，多数牦牛品种（群体）的母系遗传多样性相对较为丰富^{［7-20，28-33］}，这与本研究结果一致。然而，与野牦牛及我国其他家牦牛品种（群体）相比^{［7-20，28-33］}，甘德、达日牦牛拥有丰富的母系遗传多样性，班玛、玛沁、玛多牦牛的母系遗传多样性较为丰富，而久治牦牛的母系遗传多样性水平相对较低。可以看出，上述果洛藏族自治州6个牦牛群体的母系遗传多样性存在较大差异，这可能与各群体间遗传漂变、生存环境、选育程度及群体结构组成等存在差异相关，其具体原因有待进一步深入探究。

遗传分化指数（F_ST）和基因流（N_m ）是反映种群或个体间遗传关系和分化程度的主要指标。F_ST值越小，种群之间的遗传差异就越小，分化程度就越弱，其N_m 值就越大，提示群体间的基因交流越频繁，反之亦然。Wright^［34］研究认为，如果种群间F_ST值在0~0.05，表明群体间遗传分化很弱，F_ST值在0.05~0.15，则表明存在中等分化，F_ST值在0.15~0.25，则表示高度分化，F_ST值大于0.25，则说明群体间遗传分化程度极大。在本研究中，6个牦牛群体间的F_ST值在-0.006~0.072，N_m 值在3.222~124.750，表明这6个牦牛群体间的遗传分化具有一定差异，且存在不同程度的基因交流。值得注意的是，久治牦牛与班玛、甘德、玛沁牦牛群体间分化程度均达到中等遗传分化水平（0.05≤F_ST<0.15），基因交流相对贫乏。除此之外，其他牦牛群体间的F_ST值为-0.006~0.034（0<F_ST<0.05），表明这些牦牛群体间分化程度较弱，基因交流相对频繁。聚类分析中，6个牦牛群体聚为明显的2类，甘德牦牛与久治牦牛最先聚在一起，再与班玛牦牛聚为一类；玛多牦牛与玛沁牦牛最先聚在一起，后与达日牦牛聚为另一类；二者再聚为一起形成一大类。该聚类结果表明，久治、甘德、班玛牦牛群体间亲缘关系较近，而玛多、玛沁、达日牦牛群体间亲缘关系较近。从地理分布来看，甘德、久治、班玛牦牛群体地理位置相对距离较近，而玛多、玛沁、达日牦牛群体地理位置较近，说明本研究聚类结果所反映的群体间遗传关系与各牦牛群体间的地理分布基本一致。

系统发育分析有助于明确牦牛遗传资源的群体结构、进化历史和遗传背景。本研究中，45种单倍型分布在A、B、C、D、E和G 6种单倍型组中，其中，A单倍型组在6个牦牛群体中为优势单倍型组，这与先前关于我国多数牦牛品种（群体）的系统发育研究结果完全一致^{［7-20，28-33］}。本研究中，6个牦牛群体的45种单倍型聚为3个母系分支，即Mt-Ⅰ、Mt-Ⅱ和Mt-Ⅲ，所占比例分别为75.56%、22.22%和2.22%。然而，值得注意的是，除久治牦牛由3个母系遗传支系（即Mt-Ⅰ、Mt-Ⅱ和Mt-Ⅲ）组成外，其他5个牦牛群体均由Mt-Ⅰ和Mt-Ⅱ 2个母系支系组成，提示果洛州除久治牦牛群体有3个母系起源外，其他牦牛群体有2个母系起源。在先前的研究报道中^{［7-20，28-33］}，部分研究者基于线粒体基因组全序列及其D-loop区、蛋白编码序列等对我国家、野牦牛的系统发育进行了综合分析，表明多数家牦牛品种（群体）只拥有2个母系分支（即Mt-Ⅰ和Mt-Ⅱ），而第3个母系分支（即Mt-Ⅲ）仅存在于野牦牛、雪多牦牛和格尔木牦牛群体中且所占比例很低，推测牦牛拥有3个高度分化的母系遗传分支^{［7-20，28-33］}，这与本研究果洛州6个牦牛群体的母系遗传研究结果一致。

4　结论

青海省果洛藏族自治州6个牦牛群体均拥有特殊的母系遗传信息，母系遗传多样性较为丰富；6个牦牛群体间遗传分化程度整体较弱，除久治牦牛与班玛、甘德和玛沁牦牛群体间分化程度均呈中等遗传分化外，其他牦牛群体间分化程度均很弱；久治、甘德和班玛3个牦牛群体间亲缘关系较近，而玛多、玛沁和达日3个牦牛群体间亲缘关系较近；除久治牦牛群体由3个母系遗传支系组成外，其他群体均由2个母系支系组成，推测果洛藏族自治州除久治牦牛群体有3个母系起源外，其他牦牛群体均有2个母系起源。

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基金资助

青海省“昆仑英才·高端创新创业人才”计划（领军人才）项目和畜禽遗传资源普查项目