石斛兰杂交后代iPBS标记鉴定及遗传分析

Identification of iPBS markers and genetic analysis of Dendrobium hybrid progeny

摘要

为获取性状优良的子代单株用于后续新品种培育和优质亲本的选配，采用iPBS与形态学双标记鉴定方法，对‘粉条纹’石斛（母本）与‘丹绒之星’石斛（父本）杂交组合进行遗传鉴定研究。结果表明：iPBS标记鉴定36个子代植株均为真杂种，在遗传距离0.71处，亲本及36个子代可分为3大类群，子代先与父本聚为一类再与母本聚合，两亲本与子代的遗传相似系数父本（0.686 1）>母本（0.510 5）；形态学鉴定显示两亲本在各个性状上均存在较大差异，子代假鳞茎高度均值为25.48 cm，假鳞茎直径1.14 cm，叶片长度14.17 cm，叶片宽度3.45 cm，子代株型与叶型大小主要介于双亲间；子代花横径均值为4.96 cm，花纵径均值为5.75 cm，两者优于双亲的比例分别为16.67%和2.78%，多数子代植株花型较父母本偏小；在花部性状中，上萼宽、侧萼长宽和侧瓣长4个性状表现出一定超亲优势，唇瓣长和花梗数2个性状展现出较强的中亲优势，其余性状均呈现出不同程度的衰退趋势；子代在花色遗传上以父本的白紫色系为主，并在双亲花色色谱基础上展现梯度变化。综上，iPBS分子标记可有效提高鉴定石斛兰杂种的效率，形态学标记鉴定有助于高效选育性状优良的子代个体，2种标记方法均可有效缩短石斛兰杂交育种进程。

Abstract

In order to obtain progeny with excellent traits for subsequent breeding of new varieties and selection of high-quality parents， using iPBS and morphological double marker identification to investigate the genetic identification of the hybrid combination of Dendrobium Fancy Pink Stripe （male parent） and Den. parishii ‘Damrong Star’ 3lip （female parent）. The combination was genetically identified. The results showed that： The 36 progeny were identified true hybrids with iPBS markers. At the genetic distance of 0.71， the parents and 36 progeny could be divided into three groups， and the progeny were clustered with the male parents first and then aggregated with the female parent and the coefficients of genetic similarity between the parents and the progeny were male parent （0.686 1） > female parent （0.510 5）. Morphological identification showed significant differences in various traits between the two parents. The mean values of pseudobulb height， pseudobulb diameter， leaf length and leaf width in the hybrids generation were 25.48 cm， 1.14 cm， 14.17 cm and 3.45 cm， respectively. The size of plant and leaf type of the hybrid was mainly between the two parents； The mean values of transverse diameter and longitudinal diameter of the flower were 4.96 cm， and 5.75 cm respectively. The proportions of the two superior to their parents were 16.67% and 2.78%， respectively. And the majority of the hybrid plants had a smaller flower type than that of their parents. Among the floral traits， four traits （upper calyx width， lateral calyx length and lateral petal length） showed some supra-parental dominance， and two traits， labellum length and pedicel number， showed strong meso-parental dominance， while the rest of the traits showed different degrees of decline； The hybrid was dominated by the white-purple line of the parents in terms of the genetic inheritance of the floral colours， and showed gradient variations in the floral colours on the basis of the chromatograms of the two parents. In summary， iPBS molecular markers can effectively improve the efficiency of identifying Den. hybrids， and the morphological markers assists to efficiently select the hybrid individuals with excellent traits， and it can effectively shorten the breeding process of Den. crossbreeding by using these two types of marker.

Graphical abstract

关键词

石斛兰 / 子代鉴定 / 表型性状 / iPBS标记 / 遗传表现

Key words

Dendrobium / hybrids identification / phenotypic trait / iPBS marker / genetic performance

石斛属（Dendrobium Sw.）是兰科（Orchidaceae）中继石豆兰属（Bulbophyllum Thouars）之后的第二大属^［1］，为多年生附生型草本植物^［2］，是兰科植物中兼备观赏价值和药用价值的类群之一。作为四大观赏性洋兰之一，石斛兰相较于蝴蝶兰、文心兰和卡特兰受到的关注较少，但其药用价值却非常高。兰科植物的种子在自然状态下萌发率极低^［3］，因此，人工杂交育种就成为了兰科植物育种的手段之一，更是繁育石斛兰新品种的主要方式^［4］。

石斛兰的杂交育种最初起源于国外，20世纪50年代后，石斛兰杂交育种工作开始大规模发展，90年代后，兰科植物基因工程学迅速成为研究重点^［5］。近年来，国外学者的石斛育种工作主要集中于诱变育种和遗传变异上。Fathin等^［6］通过射线辐照幼苗使石斛植株的形态特征产生了多样性变化，获取性状不同的植株；Yuhanna等^［7］使用分子标记分析石斛兰的多样性和类群化程度，结果显示石斛属植物具有丰富的遗传多样性。国内的石斛兰育种工作开始较晚，研究的侧重点一直在结实性、组织培养和快繁技术等方面。李守岭等^［8］对齿瓣石斛进行人工授粉，发现异花授粉结实率高、自花授粉结实率低；张娟^［9］研究发现最适于秋石斛兰组织培养的是不定苗诱导和生根壮苗培养基；莫远琪等^［10］将水莲石斛幼嫩假鳞茎放入不同培养基中，可使外植体快速分化并生根发芽，达到快速繁殖的目的。但目前关于石斛兰子代的鉴别与观赏性状遗传却鲜有报道。

花径、花色和花朵数等观赏性状是育种时常关注的目标性状。杂交子代的早期鉴定对于育种工作的开展具有重要意义，可反应出子代植株在表型和基因型上的差异，帮助预选性状优良的子代单株。Inter-primer binding site（iPBS）是Kalendar等^［11］于2010年开发的一类基于反转录转座子新型分子标记。iPBS标记无需预先获得长末端重复反转录转座子（Long terminal repeat-retrotransposons，LTR）序列，具有使用成本低、步骤简单易操作以及普遍适用等优点^［12］，目前已在多种农作物中得到应用。与其他分子标记相比，iPBS标记引物多态性丰富，在植物种质资源鉴定、亲缘关系分析和遗传多样性分析等研究中更具优势^［13］，但该标记目前在石斛兰杂交育种子代鉴定方面还未获得广泛应用。形态学标记（Morphological marker）是最早期运用的鉴定方法，主要通过观察表型差异来判定子代植株更接近某一亲本^［14］，该标记具有简单、直观和便捷的特点，被广泛应用于多个物种的鉴定^［15］。因此，本研究通过对秋石斛商品品种‘粉条纹’（Den. Fancy Pink Stripe）×春石斛商品品种‘丹绒之星’（Den. parishii ‘Damrong Star’ 3lip）杂交组合开展iPBS分子标记鉴定，同时以形态学标记辅助，鉴别杂交子代真实性，探究父母本及子代间表型性状的遗传差异，研究观赏性状在子代中的遗传表现及其分离规律，旨在为石斛兰优良子代单株的预判及优质亲本选配提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

本试验于广西农业科学院花卉研究所进行，试验材料均取自花卉研究所石斛兰种质资源圃。选取‘粉条纹’石斛为母本（P1），‘丹绒之星’石斛为父本（P2）。2020年6月，将‘丹绒之星’石斛与‘粉条纹’石斛进行杂交，经人工授粉（无套袋）培育子代；当年10月收获果荚后立即进行组织培养；2021年3月出瓶培养；2022年10月，子代集中开花，立即进行形态学和分子标记鉴定。本试验将两亲本以及子代中筛选的36个杂交后代株系（子代编号：1~36）作为试验材料，父母本及杂交后代株系均剪取健康的幼嫩叶片，装入自封袋并做好标记，保存于冰盒中及时带回实验室，液氮速冻后用于基因组DNA的提取。

1.2　主要试剂及仪器

本研究使用的仪器为杭州博日科技有限公司的TC-96/G/H（b）C型LifeECO基因扩增仪，北京六一生物科技有限公司的DYY-6D型电泳仪，上海勤翔科学仪器有限公司的GEL DOCXR全自动凝胶成像系统，上海元析仪器有限公司的UV-5500（PC）型紫外分光光度计，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司的H1650-W型常温离心机，上海一恒科学仪器有限公司的HWS-26型电热恒温水浴锅，桂林量具刃有限公司的数显游标卡尺。

试剂为北京全式金生物技术有限公司的EasyPure^Ⓡ Genomic DNA Kit试剂盒和Tra-ns^Ⓡ 2K DNA Maker，康为世纪生物科技有限公司的2xEasy Taq^Ⓡ PCR SuperMix，国拓生物科技有限公司的50×TAE缓冲液，上海生工生物工程有限公司的琼脂粉。

1.3　试验方法

1.3.1　植株性状测量

2022年8月，子代植株集中开花，对亲本及部分子代植株进行性状测量。子代植株筛选时，从生长周期一致、长势相近的植株中选取36个子代。父母本及36个子代植株均测量以下性状：假鳞茎高度、假鳞茎直径、叶片长度、叶片宽度、花梗长、花梗数（枝）、花径（横径和纵径）、花萼（上萼片和侧萼片）长宽、花瓣（侧瓣和唇瓣）长宽、花色、花朵数和开花期。除花色、花朵数和开花期外的性状测量方法及表型性状的描述参照行业标准NY/T2758-2015《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 石斛属》^［16］，测量时设置3次生物学重复，最终结果取均值。测量唇瓣长宽时，主要测量其展宽，植株花朵数采用直接计数法。

1.3.2　石斛花色测定

花萼、侧瓣和唇瓣颜色复杂且不相同，将3个部分分开分析。花色层级的区分参考殷涵泰等^［17］方法，依照英国皇家园艺学会RHS植物比色卡（RHSCC）对每个色系命名：白色系（白、淡粉白和淡紫白）、粉色系（浅粉、粉）、紫色系（浅紫、紫、紫红和深紫）和复色系（白紫、粉紫）等。

1.3.3　iPBS分子标记鉴定

参照崔学强等^［18］研究方法，供试样品基因组DNA提取采用EasyPure^Ⓡ Genomic DNA Kit试剂盒进行提取并检测其完整性，用紫外分光光度计检测其浓度和纯度，提取的DNA用TE缓冲液稀释浓度至20 ng/μL，置于-20 ℃条件下保存备用。引物选用Kalendar等^［11］于2010年发表的83条引物，将父母本DNA和从子代中随机选取的2份DNA作为样本对iPBS引物进行初步筛选，从合成引物中选取扩增条带清晰、稳定性强且多态性高的引物对供试样品DNA进行PCR扩增。扩增反应总体积为20 μL：包含10 μL 2xEasy Taq^Ⓡ PCR SuperMix，8 μL无菌水，1 μL引物，1 μL模板。iPBS-PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，51 ℃（不同引物的退火温度见表1）退火45 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，扩增产物置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3.4　杂种子代真实性鉴定

利用筛选出的引物对父母本及杂交后代株系进行iPBS-PCR扩增，扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。根据电泳图谱，对比父母本条带，鉴别杂种子代中的真杂种。参照林榕燕等^［19］研究标准，将子代电泳条带中含有父本特征带的植株鉴定为真杂种，反之为假杂种。为保证最终鉴定结果的准确性，依照彭婵等^［20］试验判定标准，在研究中至少有2个或2个以上的引物鉴定为真杂种才能判定该子代植株为真杂种。

1.3.5　数据统计及分析

观察各引物电泳图谱，统计DNA条带，通过Excel 2010将电泳谱图信息转化为“0，1”矩阵，利用NTSYS-pc 2.10e统计软件进行数据分析。采用SHAN Clustering程序进行算数平均数不加权对组法（UPGMA）聚类分析，构建树状聚类图；并用DICE法计算试供材料间的遗传相似系数，分析杂种间遗传关系。所测量的表型性状数据经Excel 2010进行整理，并使用Origin 2021软件画图，参考焦振斌等^［21］方法，对所测量的表型性状计算其变异系数（CV），评估各个性状的变异程度。变异系数计算公式如下：

变异系数=（标准偏差/平均值）×100%

2　结果与分析

2.1　分子标记鉴定

2.1.1　iPBS引物扩增多态性分析

引物2232对石斛兰杂交组合种质的扩增电泳图谱见图1。从83条iPBS引物中筛选出5条清晰度高、多态性高以及重复性好的引物对石斛兰亲本及子代株系进行扩增（表1）。结果显示：5条引物共扩增出65条谱带，每条引物扩增条带数为10~15条，平均每条引物可扩增出13条谱带。其中多态性条带为63条，多态条带比率为96.92%，各条带多态比率范围为88.24%~100.00%；引物2232多态性比率最低，为88.24%，其余4个引物的多态性均为100%。扩增结果表明iPBS引物在石斛兰种质中的扩增多态性高。

2.1.2　杂合子代真实性鉴定

利用筛选的5条iPBS引物对36个子代株系进行真实性鉴定，观察对比亲本与子代扩增电泳图谱，判断真假杂种。验证杂交子代的真实性可保证后续研究建立在子代个体均为‘丹绒之星’石斛和‘粉条纹’石斛杂交子代的基础上。子代株系中，父本遗传信息渗入子代中，即子代扩增出父本特异性条带的株系为真杂种，未扩增出父本特异性条带或者只扩增出母本特异性条带的判定为假杂种。结果显示（表2）：5条引物扩增出的父本特征带范围为3~4条，引物2238鉴定出真杂种株系共31个，杂种率为86.11%；引物2249鉴定出真杂种株系共34个，杂种率为94.44%；引物2270鉴定出真杂种株系共33个，杂种率为91.67%。在引物2238、2249和2270的鉴定中，6、8、10、12、18、19、20、28、32和35号子代株系未扩增出父本特异性条带，而在引物2232和2251的扩增结果中发现，6、8、10、12、18、19、20、28、32和35号子代株系均具有父本特异性条带，鉴定为真杂种。综合5条引物的鉴定结果，试供的36个子代株系均可扩增出父本特异性条带，皆鉴定为真杂种，子代杂种率为100%，表明iPBS标记鉴定杂种效率较高。

2.1.3　亲本与子代的聚类分析

利用NTSYS-pc 2.10e统计软件计算石斛兰杂交组合种质的遗传相似系数和遗传距离，以遗传距离为基础，构建石斛兰亲本及子代的UPGMA聚类图（图2）。聚类结果显示，父母本间差异较大，在遗传距离0.71处，亲本及子代株系可划分为3大类群。第Ⅱ类群为最大的类群，包含94.74%的个体；第Ⅱ类群可划分为2个亚类，第1亚类包含父本和7、22、30、32、36号子代株系，第2亚类包含1~6、8~21、23~27、29、31、33~35号子代株系。第Ⅲ类群仅有1个子代株系28号，第Ⅰ类群也仅有母本单个个体。在子代群体中，6号与10号子代植株的遗传距离最近，2号与28号子代的遗传距离最远，所有子代个体均聚类在父母本之间。

2.1.4　亲本及子代植株遗传相似系数分析

通过DICE法计算石斛兰亲本及子代间的遗传相似系数，整个遗传相似系数矩阵变化范围为0.426 7~0.913 0，均值为0.648 3。父本与子代间遗传相似系数为0.591 5~0.773 3，其中最小值存在于父本与26号子代单株间，最大值存在于父本与36号子代单株间。母本与子代间遗传相似系数为0.426 7~0.619 0，其中最小值存在于母本与36号子代单株间，最大值存在于母本与10号子代单株间。子代植株遗传相似系数范围为0.594 6~0.913 0，遗传相似系数最小值存在于2号和28号子代单株间，最大值存在于6号和10号子代单株。在遗传相似系数矩阵的基础上，绘制石斛兰亲本及子代的遗传相似系数箱式图（图3）。父本与子代间的遗传相似系数相对于母本与子代间系数较高，子代植株与父本植株的亲缘关系较母本更近。

2.2　形态学鉴定

2.2.1　主要植株性状分析

形态学鉴定分为主要植株性状和主要观赏性状两部分。对杂交组合的亲本及子代植株性状进行统计分析和对比（表3），亲本及部分子代植株形态见图4。母本的假鳞茎高度、茎直径和叶片长度均大于父本，叶片宽度较父本更小，两亲本在主要植株性状上存在较大差异，子代植株在各性状上出现不同程度的分离。子代假鳞茎高度变幅在15.80~38.80 cm，变异系数达23.49%，变异程度中等，优于双亲值的杂种个体仅占8.33%，为主要植株性状中的最低值。假鳞茎直径占中亲值的95.40%，介于双亲间和低于双亲值的个体占全部子代植株的86.11%，近半数的子代植株假鳞茎高度及茎直径均介于双亲值之间。叶片长度占中亲值的100.50%，优于双亲的个体比例为16.67%，介于双亲间个体比例为72.22%，低于双亲值个体比例为11.11%，中亲优势明显。而叶片宽度性状介于双亲间个体和低于双亲间个体占80.55%，叶型相较于亲本呈减小趋势。总体上，子代植株同时表现出父母本双方的性状特征，中亲优势明显，部分子代的主要植株性状表现出一定程度的衰退。子代植株形态、叶片长度和叶片宽度性状更偏向母本，图4中也可看出叶姿态、叶片形状偏母本遗传，仅有茎高度、茎直径性状偏向父本，主要植株性状更偏向母本遗传。

2.2.2　主要观赏性状分析

花部性状是育种主要关注的目标之一，母本的花型较父本更大，花梗长且花朵数更多，双亲间各观赏性状存在一定差异。在统计的子代植株观赏性状中，母本、父本的花梗数分别为2和1枝，花朵数分别为10和7朵，子代花梗数变幅在1.00~3.00，优于双亲值的个体仅占2.78%，97.22%的个体介于双亲值之间；子代的花朵数数量变幅在4.00~16.00，其中优于双亲值和介于双亲值的个体各占16.67%，小于双亲值的个体占66.67%。花纵径和花横径的变异系数分别为11.76%和14.24%，两者的离散程度相差不大，相较于亲本，多数子代花大小呈减小趋势（表4）。子代植株的上萼长、侧瓣宽、唇瓣宽、花梗长和花朵数5个性状低于双亲值的个体超过半数，分别为52.78%、88.89%、94.44%、63.89%和66.67%，子代植株在这5个性状上呈衰退趋势；上萼宽、侧萼长、侧萼宽和侧瓣长4个指标优于亲本的个体占比分别为30.56%、30.56%、44.44%和30.56%，具有一定的超亲优势；唇瓣长和花梗数2个性状低亲值与高亲值均较低，中亲值分别为52.78%和97.22%，展现较强的中亲优势。除花梗长、花梗数和花朵数3个性状外，其余花部性状变异系数范围在6.68%~14.24%，子代植株花部性状分离程度不高。上萼宽、侧萼长、侧萼宽、侧瓣长、侧瓣宽和唇瓣宽等花部性状更倾向于母本遗传，同时，从图5中也可看出，子代花型、花展开状态、花瓣和萼片形态也更倾向于母本，剩余少部分性状表现为倾父本遗传。

相较于亲本，杂交子代的花色更为丰富，表现出明显的杂种优势（表5和6）。在花色上，父本主要表现为紫色和白色混合的复色系，母本主要表现为粉紫色系，子代植株中不仅包含双亲的颜色，还出现了以白色为主的花朵。在子代花萼颜色中，纯色系占比83.33%，复色系占比16.67%，花萼颜色以纯色为主，其中白色花萼比例最高；子代侧瓣颜色分离均衡，纯色系与复色系占比均为50%，其中“白/浅紫”复色侧瓣占比最高；子代唇瓣颜色分离较广泛，纯色系仅有深紫色，占比为8.33%，复色系颜色丰富且占比达到了91.67%，其中“白/深紫”的唇瓣比例最大。在双亲花色遗传方面，父本植株的白色系与紫色系的遗传能力远大于母本植株浅粉色系的遗传能力，子代植株花色总体以紫色系与白色系为主，表现出明显的倾父本遗传的倾向。杂种花色虽分离广泛，但未出现双亲色谱之外的颜色，花色深浅呈梯度变化，并未出现较大变异。

母本‘粉条纹’石斛和父本‘丹绒之星’石斛的着色模式分别为条纹和隐条纹，在子代群体中除了遗传父母本性状外，还出现了无线条个体。子代群体中花瓣表现为无线条的个体为7个，占总数的19.44%；表现出线条特征的个体为17个，占47.22%；表现隐线条的个体为12个，占33.33%。结果表明，近一半的子代个体其花瓣着色模式遗传了母本的线条特征。

父本‘丹绒之星’石斛（春石斛）其花序于叶腋抽出，开花期主要为每年的3—4月；母本‘粉条纹’石斛（秋石斛）其花序于假鳞茎顶端抽出，开花期为每年的8—10月。子代花序同样从茎顶端抽出，开花期为每年的9—11月。从花序位置及开花期来看，子代主要遗传母本植株，经主要植株性状和花部性状对比，子代大部分性状更倾向于母本遗传。

3　讨论

3.1　iPBS标记提高鉴定石斛兰杂种的效率

对杂交子代的真实性进行鉴定是育种中的关键一环，鉴别出真杂种是杂交育种工作的前提，可有效缩短石斛兰育种周期。形态学鉴定方法虽简单直观，但易受到环境影响^［22］。DNA分子标记是目前进行植物种质鉴定、遗传关系和遗传多样性分析的有效方法^［23］，其准确、高效的特点已广泛应用于多个物种的杂种子代鉴定研究中。iPBS标记作为一类新型分子标记，使用率对比其他分子标记来说较少。本研究中，5条iPBS引物多态比例在88.24%~100%，略高于SRAP标记^［24］；36个子代植株均为真杂种，表明iPBS引物在石斛兰中的扩增多态性较高，鉴别效果好，该标记适用于石斛兰杂交子代的鉴定工作。聚类图显示，母本与子代植株间遗传距离较远，子代植株先与父本聚类，后与母本聚合。从遗传学的角度上来说，子代植株的植株性状一般更偏向于母本遗传，而分子研究结果显示更偏向于父本，其原因可能为父本植株遗传能力大于母本。整个遗传相似系数矩阵变幅为0.436 7~0.913 0，证明植株间遗传多样性较丰富，有利于具有杂种优势的个体出现，可在子代中选取性状优良的个体进行下一步杂交，利于得到优势个体。研究认为iPBS分子标记可有效应用于石斛兰杂交育种鉴定工作，分析物种遗传多样性。但不同分子标记其检测特点和灵敏度不同，对同一物种的鉴定结果可能存在差异，后续试验也可以采取其他的分子标记应用于石斛兰杂种子代鉴定，或者采用多标记联合鉴定，进行对比研究。

3.2　形态学标记鉴定有助于选育性状优良杂交子代

杂交育种有利于综合双亲的优良性状，是获取具有双亲优势子代个体的有效方法，分析亲本及子代间性状的遗传规律，发掘杂种优势个体，对选育性状优良的新品种具有重要意义。花部性状常用于植物种质的鉴定，对花性状的遗传评价有助于植物种质收集和新品种开发的多样性评价^［25］。以往研究中，对杂种子代表型性状遗传表现的研究主要集中在蝴蝶兰上^［26-27］，对石斛杂交子代性状遗传表现的研究非常少，仅有陈和明等^［28］对秋石斛兰的F₁代主要观赏性状的遗传进行研究以及刘靓等^［29］通过春石斛表型性状分析揭示各种质间的遗传关系。本试验通过对亲本及杂交子代的表型性状进行对比分析发现，子代的上萼长、侧瓣宽、唇瓣宽、花梗长和花朵数5个性状衰退趋势明显，表现为负向的超亲优势；假鳞茎高度、叶片宽度和花径性状的平均值较中亲值有所下降，在高山杜鹃和蝴蝶兰等观赏花卉中也存在类似情况。除上萼宽、侧萼长宽和侧瓣长4个性状表现出一定的超亲优势外，其余性状均出现不同程度的衰退，原因可能与亲本有关，亲本高度杂合，经有性繁殖后杂种植株性状出现分离，导致子代群体的各性状整体下降。花色遗传方面，子代花瓣颜色主要遗传亲本色系，颜色深浅呈不同梯度变化，未有新颜色出现。俞继英等^［30］研究中，黄色系蝴蝶兰子代花瓣颜色基本遗传亲本特点；韦小莲等^［31］研究显示，香型多花蝴蝶兰杂交后代花色基本为亲本调和色，未出现双亲色谱范围外的颜色，这与前人研究结果基本一致。李娟娟等^［32］将植株性状遗传变异系数划分为3个等级，0~15%：变异程度较小；15%~30%：变异程度中等；>30%：变异程度较大，变异程度达中等及以上时可认为该性状具有育种的价值和潜力。本研究中，大部分性状的变异程度较小，茎高、叶宽和花梗长3个性状变异程度达中等，花梗数、花朵数和花色3个性状的变异程度较大，因此在子代中选育性状优良的石斛兰新品种是有可能的。

3.3　形态学标记与iPBS标记鉴定分析的差异

本研究中采用形态学标记和iPBS标记共同鉴定石斛兰杂交子代植株，形态学标记鉴定结果显示在主要植株性状和观赏性状上，子代更倾向于母本遗传。根据iPBS分子标记鉴定，子代个体在聚类分析和遗传相似系数等遗传分析上更倾向于父本遗传，形态学标记鉴定与iPBS标记鉴定结果不一致。前人研究中也存在形态学鉴定与分子鉴定结果不一致的情况^［33-34］，原因可能是形态学标记是基于植株重要表型性状作为划分依据，而iPBS标记是基于整个植物基因组DNA多态鉴定结果，分组依据的不同导致结果出现差异^［35］。一方面，虽然基因控制性状，但生长环境也对子代个体的表型性状造成一定程度的影响^［36］；另一方面，控制植株性状表达的基因片段可能与分子试验所标记基因位置不同有关^［36］。在后续研究中可使用其他不同的分子标记对杂交子代进行进一步鉴定，以期获得更准确的研究结果。

4　结论

利用双标记对石斛兰杂交子代进行鉴定，iPBS分子标记鉴定结果显示，36个子代植株均为真杂种，子代群体遗传多样性较高，聚类分析与遗传相似系数分析表明子代与父本的亲缘关系相较于母本更近；形态学标记鉴定显示，子代植株在表型的遗传上，同时显现出父母本双方的性状特征。形态学标记结果与分子标记结果既相同又存在差异，2种标记方法鉴定结果不完全一致。因此，形态学标记联合iPBS标记鉴定方法可以有选择性地应用于杂交子代个体中，可更高效选育父母本的优势性状，有利于石斛兰植株定向杂交育种工作的开展。

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基金资助

广西重点研发计划项目(桂科AB21220056)

广西农业科学院基本科研业务专项(桂农科2023YM115)

广西农业科学院基本科研业务专项(桂农科2021YT133)

广西自然科学基金项目(2020GXNSFBA297021)