肠炎沙门菌噬菌体vB_SalP_QS的生物学特性及治疗小鼠沙门菌肠道感染的研究

Biological characterization of Salmonella enterica phage vB_SalP_QS and treatment of Salmonella enteric infection in mice

摘要

为探索针对耐药沙门菌的噬菌体治疗方法，以沙门菌SE-21为宿主菌，从污水中分离得到一株烈性噬菌体并命名为vB_SalP_QS。在鉴定vB_SalP_QS生物学特性的基础上，对vB_SalP_QS和vB_SalP_SE29混合噬菌体治疗由沙门菌SE-21引起小鼠肠炎的治疗效果进行评价。结果表明：1）电镜观察可见该噬菌体属于有尾病毒目（Caudovirales），其效价为8×10⁸ PFU/mL。2）vB_SalP_QS的最佳感染复数（MOI）为0.01，潜伏期为40 min，裂解期为50 min。温度为4~60 ℃具有较好的活性，在pH 4~pH 10范围内非常稳定。平板点滴法试验表明vB_SalP_QS可以裂解17株沙门菌，裂解率为44.7%。3）噬菌体vB_SalP_QS的全基因组测序分析显示，噬菌体vB_SalP_QS全长42 293 bp，GC含量为49%，共含有72个开放阅读框，且不含有溶源性、毒力因子及整合酶基因。4）小鼠体内治疗试验显示，宿主菌SE-21对小鼠最小致死量为5×10⁸ CFU/mL，感染小鼠经vB_SalP_QS （100 μL 1×10⁷ PFU/mL）和vB_SalP_SE29 （100 μL 1×10⁷ PFU/mL）混合治疗后存活率为100%，单独用vB_SalP_QS治疗组 （200 μL 1×10⁷ PFU/mL）的小鼠存活率为80%，单独用vB_SalP_SE29治疗组（200 μL 1×10⁷ PFU/mL）的小鼠存活率为70%，对照组全部死亡。5）病理组织观察表明，混合噬菌体可以有效杀灭沙门菌SE-21的同时，还能更好地保护小鼠肠绒毛，可显著提高感染SE-21的小鼠存活率。综上，噬菌体vB_SalP_QS具有良好的酸碱稳定性、热稳定性以及安全性，混合噬菌体联合治疗效果优于噬菌体单一治疗。本研究为噬菌体制剂治疗沙门菌感染提供了重要依据，也为混合噬菌体鸡尾酒疗法的临床应用奠定基础。

Abstract

In order to study the phage therapy methods for drug-resistant Salmonella， a virulent bacteriophage was isolated from sewage with Salmonella SE-21 as the host bacterium and named vB_SalP_QS. On the baisis of identifying the biological characteristics of vB_SalP_QS， vB_SalP_QSand vB_SalP_SE29 hybrid phage for the treatment of enteritis in mice caused by SE-21 was evaluated. The results showed that： 1） The phage belonged to the order of caudoviruses （Caudovirales） by electron microscopy. The potency of the phage was 8×10⁸ PFU/mL. 2） Biological characterization showed that the phage vB_SalP_QS had an optimal multiplicity of infection （MOI） of 0.01， with an incubation period of about 40 min， and a lysis period of about 50 min. It had good activity at temperatures ranging from 4 ℃ to 60 ℃， and it was very stable within the range of pH 4-pH 10. vB_SalP_QS could lyse 17 strains of Salmonella by The plate spot test. The cracking rate was 44.7%. 3） The phage vB_SalP_QS was 42 293 bp in total length， had a GC content of 49%， contained a total of 72 open reading frames （ORFs）， and had no lysogeny， virulence factors， and integrase genes.4） In vivo therapeutic tests in mice showed that the minimum lethal dose of the host bacterium SE-21 was 5 × 10⁸ CFU/ mL， and the survival rate of infected mice treated with vB_SalP_QS （100 μL 1 × 10⁷ PFU/mL） and vB_SalP_SE29 （100 μL 1 × 10⁷ PFU/mL） was 100%. The survival rate of mice in the vB_SalP_QS treatment group （200 μL 1 × 10⁷ PFU/mL） was 80%. The survival rate of mice in the vB_SalP_SE29 treatment group （200 μL 1 × 10⁷ PFU/mL） was 70%. All control mice died. 5） Pathological observations showed that mixed phage could effectively kill Salmonella SE-21 and also better protect the intestinal villi of mice， which could significantly improve the survival rate of mice infected with SE-21. In conclusion， phage vB_SalP_QS has good acid-base， thermal stability as well as safety， and the therapeutic effect of mixed phage combination therapy is higher than that of phage monotherapy. This study provides an important experimental basis for the treatment of Salmonella infections with phage preparations and lays the foundation for the clinical application of mixed phage therapy.

Graphical abstract

关键词

沙门菌 / 混合噬菌体 / 全基因组测序 / 生物学特性 / 治疗效果

Key words

Salmonella / mixed phage / whole-genome sequencing / biological properties / therapeutic effect

沙门菌（Salmonella）属于肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，是一种人兽共患病原菌^［1］，也是全世界范围内常见的食源性病原菌，可引起畜禽产生败血症、肠炎、腹泻等各种疾病并导致人类产生小肠结肠炎、菌血症及腹泻等。治疗沙门菌造成的肠道感染，传统方法多采用抗生素治疗。然而，随着沙门菌对多种常用抗生素耐药性的增加，肠道沙门菌感染的治疗变得更具难度。因此，迫切需要开发一种新的针对沙门菌感染的治疗策略。

噬菌体（Bacteriophage）是一种能在细菌体内完成自我生长繁殖的病毒，广泛分布于自然环境中。噬菌体对细菌具有高度特异性，能够特异性感染杀死其目的菌株，并且不会对机体的正常菌群产生影响^［2］。此外，噬菌体的分离途径简单，研发周期短，所需成本低^［3］。治疗过程中所需剂量较少，进入动物机体能够快速遍布全身，具有少量、高效等优点^［4］。目前，噬菌体疗法已被广泛应用于抑制细菌的生长和感染的治疗中^［5］，Cheng等^［6］研究指出噬菌体可有效杀灭耐万古霉素的粪肠球菌，并缓解小鼠菌血症模型中的肠道菌群失衡。Atterbury等^［7］研究指出，噬菌体具有对抗沙门菌感染的潜力，特别是在减少沙门菌在鸡体内的定植和降低发病率方面。Boire等^［8］通过口服噬菌体能够有效降低雏鸡体内沙门菌的数量。

高度特异性是制约噬菌体治疗细菌感染的一个主要因素，而混合噬菌体疗法（鸡尾酒疗法）是将多种噬菌体联合应用来杀灭细菌的一种治疗方法，其可有效的解决噬菌体特异性强这一问题，并对噬菌体耐药菌具有疗效，从而在很大程度上提高噬菌体的可应用性^［9］。范亚娟^［10］研究表明，混合噬菌体鸡尾酒制剂在一定时间内有杀灭鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌的效果，在1 h内可杀灭90%以上的细菌，高效杀菌效果可持续3 h。李越^［11］研究表明，靶向细菌不同受体的噬菌体鸡尾酒制剂在体外有效延缓噬菌体抗性发展，在体内有效降低雏鸡肠道中沙门菌载量，降低炎症因子表达，维持肠道组织正常结构。杨玉莹^［12］的研究指出噬菌体鸡尾酒制剂比单一噬菌体抑制沙门菌的能力更强。Gao等^［13］研究指出，噬菌体鸡尾酒针对抗性肠炎沙门氏菌的适应性权衡导致抗生素敏感性增加和毒性降低。但是噬菌体在治疗过程中存在特异性强、易产生噬菌体抗性细菌等问题，因此，寻找裂解能力强、安全稳定的噬菌体以及研制混合噬菌体制剂对于高效治疗沙门菌感染非常重要。基于此，本研究以耐药沙门菌SE-21为宿主菌，从污水中分离得到一株对其有强裂解能力的烈性噬菌体vB_SalP_QS，分析其生物学特性和全基因组，并运用噬菌体vB_SalP_QS联合有共同宿主菌SE-21的噬菌体vB_SalP_SE29（实验室分离并保存）构建了混合噬菌体制剂，并且评价了其安全性以及体内、体外的治疗效果，为混合噬菌体疗法的临床应用提供重要依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株、样品及实验动物

本研究所需的菌株S. typhimurium-CVCC2229购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，S. enteritidis-CMCCB50041购自中国医学细菌保藏管理中心，其余所需菌株均由本实验室分离并保存。污水样品采自长春市各大医院、河流及养殖场；噬菌体vB_SalP_SE29为实验室分离并保存（已知其生物学特性，已完成全基因组测序）；实验用SPF级6~8周昆明小鼠购买自辽宁长生生物股份有限公司。

1.1.2　主要试剂

酵母提取物、DNaseI、RNaseA等试剂购自北京索莱宝科技有限公司；氯仿购自华天生物科技有限公司；病毒DNA提取试剂盒购自OMEGA。

1.2　方法

1.2.1　噬菌体的分离纯化及效价鉴定

取100 mL污水加入1 mL对数期的宿主菌 SE-21，37 ℃、180 r/min培养6~7 h，10 000 r/min离心 1 min，0.22 μm滤膜过滤。双层琼脂平板法37 ℃过夜培养，挑取单个噬菌斑加入宿主菌SE-21中，37 ℃培养4~6 h，离心过滤即为噬菌体增殖原液。重复上述操作，直到平板出现的噬菌斑形状大小均一，即获得纯化的噬菌体^［14］，命名为vB_SalP_QS。

取100 μL噬菌体浓缩液滴于铜网上，自然沉淀15 min，利用2%的磷钨酸（PTA）对噬菌体染色，利用透射电镜观察并记录噬菌体形态和大小。将纯化好的噬菌体双层平板法培养，选择噬菌斑范围在20~300个的平板进行计数。重复3次计算噬菌体效价。

噬菌体效价（PFU/mL）=噬菌斑平均数×稀释倍数/0.1 mL。

1.2.2　噬菌体vB_SalP_QS裂解谱、最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线的测定

利用点滴法测定vB_SalP_QS的宿主谱，测试菌株为28株沙门菌和10株大肠杆菌。若观察到清晰的噬菌体裂解圈，则表明噬菌体能有效裂解该菌株。

将噬菌体悬液10倍倍比稀释后（MOI＝10~0.001）与对数生长期的宿主菌SE-21混合，37 ℃，180 r/min培养6 h，离心过滤膜，利用双层平板法测定其最高滴度即为噬菌体最佳MOI。

以最佳MOI向试管中加入噬菌体和SE-21，37 ℃孵育15 min，离心弃上清后重悬于等体积37 ℃预热的LB液体培养基，37 ℃恒温培养。从试验起始，每10 min取样1次至130 min结束，滤膜除菌，双层平板法测定其滴度，绘制噬菌体vB_SalP_QS的一步生长曲线。

1.2.3　噬菌体vB_SalP_QS的最适温度及 pH测定

取8×10⁸ PFU/mL噬菌体裂解液0.5 mL分别放入不同温度（4、25、37、50、60、70和80 ℃）恒温水浴锅中，每隔10 min取样至60 min，双层平板法检测噬菌体效价。取0.1 mL 8×10⁸ PFU/mL噬菌体裂解液与37 ℃预温的各pH（pH 2~pH 12）SM液0.9 mL混合，37 ℃恒温水浴1.5 h，检测噬菌体效价，平行检测3次。

1.2.4　噬菌体vB_SalP_QS体外杀菌活性的检测

取1 mL对数期SE-21菌液分别接种于2个100 mL无菌LB液体培养基中，37 ℃的恒温培养2 h；按照最优的MOI值，将噬菌体vB_SalP_QS，vB_SalP_SE29及混合噬菌体（vB_SalP_QS＋vB_SalP_SE29）增殖液加入至其中一个LB液体培养基中进一步培养，另一个无菌LB液体培养基作为参照组不加入噬菌体。37 ℃、180 r/min恒温培养160 min。从培养开始起，每隔10 min对培养液进行采样，测定其OD₆₀₀的吸光值变化^［6］。

1.2.5　噬菌体基因组提取及生物信息学分析

利用病毒DNA提取试剂盒提取噬菌体vB_SalP_QS的全基因组并送至北京诺禾致源生物科技有限公司，利用Illumina novaseq进行全基因组测序，SPAdes软件进行组装拼接。CGView绘制噬菌体的全基因组图谱，NCBI-BLAST比对噬菌体的ORF并对阅读框进行注释。通过GO和KEGG等数据库进行快速注释来预测存在的编码序列（CDS）及其功能，Genbank和BLAST比较和整合分析预测的开放阅读框架（ORFs）。通过NCBI及噬菌体注释工具PHASTER进行预测和比较分析每个阅读框的功能，以寻找较高相似性的功能。利用MEGA11软件运用Neighbour Joining构建DNA序列比对得到最初发育树结果。

1.2.6　噬菌体vB_SalP_QS体内治疗效果的评估

1.2.6.1　沙门菌SE-21最小致死量的确定

将小鼠随机分为6组，每组10只，每只小鼠的注射体积均为200 μL， 对照组攻毒时用PBS，具体分组与攻毒剂量见表1。观察并记录7 d内小鼠的死亡数，确定最小致死量（MLD）。

1.2.6.2　噬菌体vB_SalP_QS、vB_SalP_SE29及混合噬菌体鸡尾酒治疗效果分析

将小鼠随机分为5组，每组10只。以2×MLD腹腔接种SE-21。在接种1 h后分别腹腔注射200 μL 1×10⁵~ 1×10⁸ PFU/mL的噬菌体vB_SalP_QS和vB_SalP_SE29，对照组小鼠则腹腔注射等量无菌PBS缓冲液，具体分组治疗剂量见表2，观察并记录小鼠7 d的存活及健康情况。

小鼠的健康状况根据疾病的进展程度分为0到5级^［12］。健康正常（5分）；轻微疾病，身体活动减少和皮毛皱褶（4分）；中度疾病，如嗜睡和驼背（3分）；严重病情有上述症状，再加上部分闭眼周围渗出物堆积（2分）；濒死状态（1分）；死亡（0分）。

1.2.6.3　噬菌体vB_SalP_QS安全性试验

参考赵以恒^［15］的方法，分别将噬菌体vB_SalP_QS （1×10⁷ PFU/mL， 100 μL）和vB_SalP_SE29 （1×10⁷ PFU/mL， 100 μL）制成混合噬菌体制剂。试验设计分组与注射剂量见表3，腹腔注射后观察7 d。每天观察小鼠的变化，并记录死亡数。

1.2.7　噬菌体治疗后小鼠肠道组织病理学观察

在分别用噬菌体vB_SalP_QS、噬菌体vB_SalP_SE29以及混合噬菌体治疗48 h后采集小鼠空肠、回肠、十二指肠浸泡在组织固定液中，置于4 ℃冰箱固定24 h以上；横向提取肠管样本并对肠管两侧修剪整齐；使用无水乙醇由低至高浓度脱水（即75%→80%→85%→90%→95%→100%）进行梯度脱水；二甲苯进行透明处理；将组织在56 ℃的蜡浴中浸蜡后包埋；切割宽度约为3 μm。将切片放入展片池（40 ℃）中促使其彻底铺展，待切片完全展平后80 ℃干燥1 h用HE染色。

2　结果与分析

2.1　噬菌体vB_SalP_QS纯化及效价测定

以沙门菌SE-21为宿主菌，从污水中分离得到噬菌体vB_SalP_QS。利用双层平板法传代培养6次后得到大小形态均一的噬菌斑（图1（a）），大小约为3.2 mm。经6轮纯化后，通过将噬菌体倍比稀释与宿主菌SE-21双层平板法培养，测得其效价为8×10⁸ PFU/mL。电镜观察可见，该噬菌体头部为典型二十面体并且尾部较长（图1（b）），全长（200±2） nm，头部直径为（75±2） nm，尾部长（135±2） nm。根据国际噬菌体分类标准（ICTV），该噬菌体属于有尾噬菌体目（Caudovirales）。

2.2　噬菌体vB_SalP_QS裂解谱、最佳 MOI和一步生长曲线的测定

通过点滴法测定噬菌体vB_SalP_QS的裂解谱，共验证38株菌，其中包括28株沙门菌，10株大肠杆菌。vB_SalP_QS可裂解17株沙门菌，裂解率为44.7%（表4）。

噬菌体最佳感染复数结果显示，vB_SalP_QS在MOI=0.01时滴度最高（图2（a））。一步生长曲线结果显示，前40 min上升缓慢，40~90 min上升较快，90 min后曲线较为平稳（图2（b）），表明噬菌体vB_SalP_QS的潜伏期约为40 min，裂解期约为50 min，90 min后趋于平稳。

2.3　噬菌体最适温度及pH测定

噬菌体最适温度及pH测定结果显示，vB_SalP_QS在4~60 ℃基本可以保持活性，超过60 ℃时噬菌体活性较低，当温度达到70 ℃并持续40 min以及80 ℃持续20 min时完全失去活性（图3（a））。vB_SalP_QS在pH 4~pH 10效价变化不显著（P>0.05）（图3（b））。结果表明，vB_SalP_QS温度为4~60 ℃，pH 4~pH 10范围内均有较好的活性。

2.4　噬菌体vB_SalP_QS对宿主菌SE-21的裂解活性

噬菌体vB_SalP_QS对沙门菌SE-21体外杀菌试验结果如图4所示，噬菌体vB_SalP_QS处理组前40 min OD₆₀₀呈现上升趋势噬菌体可能处于潜伏期，40 min后至160 min出现相对明显的下降，表明噬菌体vB_SalP_QS对宿主菌SE-21具有体外强裂解活性。噬菌体vB_SalP_SE29为实验室分离并保存，前期研究表明噬菌体vB_SalP_SE29与噬菌体vB_SalP_QS有着共同的宿主菌SE-21，且噬菌体vB_SalP_SE29对宿主菌SE-21也有很好的裂解效果。噬菌体vB_SalP_QS，vB_SalP_SE29及混合噬菌体（vB_SalP_QS＋vB_SalP_SE29）对沙门菌SE-21体外杀菌试验结果如图4所示，3组噬菌体均具有体外裂解活性并且在40 min之后混合噬菌体组的杀菌效率显著高于单一噬菌体组。而在150 min后单一噬菌体处理组的OD₆₀₀呈上升或平行趋势，而混合噬菌体处理组的OD₆₀₀仍处于下降趋势，借此推断单一噬菌体处理组可能是产生了抗性菌株，而混合噬菌体组可以很好的遏制抗性菌株的出现且可以更好的杀灭沙门菌SE-21。

2.5　噬菌体vB_SalP_QS基因组学分析

噬菌体vB_SalP_QS全基因组长度为42 293 bp，GC含量为49.53%，编码72个预测开放阅读框（ORFs）（图5（a））。通过对所有ORF的编码蛋白进行基因序列比较，结果发现，其中35个ORF（49%）编码的蛋白与数据库中已知功能的蛋白存在同源性；而剩余的37个ORF（51%）编码的蛋白质功能尚不明确。噬菌体vB_SalP_QS基因组的平均ORF大小为556.58 bp，所有ORF编码蛋白的分子质量范围从3.1 ~92.4 ku，最小的编码单元为ORF20，其编码了29个氨基酸；而最大的为ORF09，其编码了828个氨基酸。

噬菌体vB_SalP_QS发育树结果如图5（b）所示。选取与噬菌体vB_SalP_QS同源性及序列覆盖率均超过90%的21株噬菌体，其中包括Salmonella phage vB_SalP_LDW16（登录号NC 073194.1）、Salmonella phage vB_SenS_SP8（ON381768.1）、Salmonella phage vB_SpuS_Sp4（MH358359.1）等20株沙门菌噬菌体及1株气单胞菌噬菌体Aeromonas phage PZL-Ah152（MW671054.1）。结果表明噬菌体vB_SalP_QS、Salmonella phage vB_SalP_LDW16和Salmonella phage vB_SenS_SP8位于同一个分支，均属于Salmonella phage，这表明它们之间具有较高的遗传关系。

2.6　沙门菌SE-21引起小鼠最小致死量的确定

小鼠腹腔接种不同剂量沙门菌SE-21，攻毒组全部死亡的剂量是5×10⁹ CFU/mL和5×10⁸ CFU/mL（图6），即沙门菌SE-21的MLD是5×10⁸ CFU/mL，且24 h时活着的小鼠出现严重症状，精神萎靡、呆滞、禁食、全身蜷缩、活动困难、被毛杂乱、肛门有少许分泌物，睁眼困难且眼角出现黄白色粘稠分泌物。

2.7　噬菌体的治疗剂量及存活率的检测

小鼠腹腔治疗结果表明，vB_SalP_QS（200 μL 1.0×10⁵ PFU/mL~1.0×10⁸ PFU/mL）的保护率分别是30%、60%、80%和100%（图7（a）），vB_SalP_SE29的保护率分别是30%、50%、70%和90%（图7（b））。综上，后续联合治疗试验，vB_SalP_QS和vB_SalP_SE29的用量均选择200 μL 1.0×10⁷ PFU/mL。

噬菌体治疗后对小鼠的保护率结果如图7（c）所示；小鼠腹腔接种2×MLD的沙门菌SE-21，1 h后分别用vB_SalP_QS（200 μL 1.0×10⁷ PFU/mL）单独治疗，vB_SalP_SE29（200 μL 1.0×10⁷ PFU/mL）单独治疗以及混合噬菌体也是以1.0×10⁷ PFU/mL（vB_SalP_QS/100 μL＋vB_SalP_SE29/100 μL）混合治疗小鼠。结果显示，混合噬菌体1周内小鼠存活率仍为100%，单独vB_SalP_QS治疗组的小鼠存活率为80%，而单独vB_SalP_SE29治疗组的小鼠存活率为70%，对照组小鼠在第3天全部死亡。

采用上述治疗方案进行治疗后观察小鼠的健康状况，24 h内对照组小鼠平均得分为0.2分，单一噬菌体vB_SalP_SE29组平均得分为2分，单一噬菌体vB_SalP_QS组平均得分为2.6分，混合噬菌体组平均得分为4.1分；混合噬菌体治疗效果高于单一噬菌体治疗效果（图7（d））。

2.8　噬菌体vB_SalP_QS和vB_SalP_SE29安全性测定

3组噬菌体试验组和1组PBS对照组腹腔接种后一周内均未出现任何临床症状，生长状况良好，存活率均为100%。脱颈处死小鼠后，剖检也均未发现有病理变化。结果表明噬菌体对试验小鼠具有良好的安全性。

2.9　病理组织切片的观察

用各组小鼠十二指肠、空肠和回肠组织制备病理切片（图8）。攻毒对照组小鼠（图8（b））可见小肠组织出血，肠系膜显示出液化特征，结肠内粪便不成形，呈土黄色恶臭稀便，回肠组织炎性细胞明显增多，肠绒毛断裂萎缩，排列稀疏。混合噬菌体（vB_SalP_QS+vB_SalP_SE29）治疗组与单一噬菌体组（vB_SalP_QS）和（vB_SalP_SE29）治疗组相比，混合噬菌体治疗组（图（c））的小鼠肠绒毛与正常组小鼠（图（a））相接近，排列比较整齐。与攻毒对照组相比，治疗组小鼠未见小肠出血变化。病理组织学结果表明：经噬菌体治疗能够有效减轻小鼠感染沙门菌SE-21肠道的病理变化，减缓疾病引发的症状，且混合噬菌体对小鼠肠炎的治疗效果要优于单一噬菌体。

3　讨 论

沙门菌（Salmonella）是一种常见的肠道致病菌，对人类和动物的健康造成了严重威胁。在治疗领域，传统治疗方法多采用抗生素治疗。然而在过去的几十年里，随着抗生素的滥用，沙门菌对多种常用抗生素耐药性增加导致传统抗生素治疗出现了一系列的限制和挑战^［16］，如治疗效果不佳、耐药性提高等。根据统计，到2050年，每年将有一千万人死于多重耐药性细菌感染^［17］，这些耐药沙门菌菌株在人类和动物中迅速传播，给公共卫生和养殖业造成了巨大的危害。

噬菌体是一种针对细菌感染的病毒，具有高度的特异性和选择性。近年来，越来越多的研究表明，噬菌体在治疗沙门菌肠道感染方面具有巨大的潜力。噬菌体疗法作为一种潜在的减抗替抗方案在治疗领域备受关注^［18］，噬菌体安全、有效、无耐药性且不破坏机体内体的菌群结构，可以利用细菌宿主在体内快速增加数量且可以穿透生物膜。噬菌体治疗细菌感染时，免疫系统和噬菌体之间会出现一种协同作用，会存在一种动态平衡的过程，即通过噬菌体的作用降低病原菌的数量，减轻感染严重程度，为免疫系统提供更好的清除残余病原菌的条件，最终实现控制感染和治愈的效果。这种相互作用被称为“免疫噬菌体协同”，强调了噬菌体疗法与免疫系统之间的协同效应，以达到更好的治疗效果。

应用单一噬菌体治疗存在宿主范围窄、细菌易产生噬菌体耐药性等缺点，而应用混合噬菌体鸡尾酒疗法能够有效地扩展噬菌体的靶菌谱^［12］，能够减少抗性菌的产生，还能够提高治疗的成功率。2009年，噬菌体鸡尾酒疗法（Biphage-PA）第一阶段临床试验获得美国FDA批准^［19］。噬菌体体外裂解试验中单一噬菌体组OD₆₀₀在150 min后出现略微上升或平行趋势而混合噬菌体组仍然处于下降趋势，推测单一噬菌体组可能出现了抗性菌株，而混合噬菌体可以遏制抗性菌的出现。从噬菌体对小鼠保护率试验结果可以看出，混合噬菌体（vB_SalP_QS+vB_SalP_SE29）治疗组存活率可以达到100%，而单一噬菌体组存活率分别为70%和80%。混合噬菌体治疗组可以有效的杀灭病原菌以及控制并延长抗性菌出现的时间，给机体免疫系统更多的时间去识别清除残留的、未被噬菌体消灭的病原菌，最终将病原菌彻底清除。说明混合噬菌体（vB_SalP_QS+vB_SalP_SE29）对小鼠感染沙门菌后保护效果更好。刘晓贺^［9］研究表明，将2种特异性噬菌体联合使用，治疗细菌感染的治愈率显著提高。另外，一项针对多重耐药肺炎克雷伯菌感染^［20］的噬菌体治疗研究显示，噬菌体鸡尾酒疗法能够有效抑制细菌生长。

综上所述，噬菌体vB_SalP_QS具有良好的酸碱耐受性、热稳定性以及安全性，联合应用vB_SalP_QS和vB_SalP_SE29混合噬菌体可以有效的杀灭小鼠体内沙门菌SE-21，能够显著提高感染SE-21的小鼠的存活率，病理组织切片结果显示混合噬菌体比单独噬菌体表现出更大的应用潜力。为噬菌体制剂治疗沙门菌感染提供了重要依据，也为混合噬菌体鸡尾酒疗法的临床应用奠定了基础。

4　结 论

本研究分离到的噬菌体vB_SalP_QS具有良好的酸碱耐受性、热稳定性及安全性。混合噬菌体组（vB_SalP_QS+vB_SalP_SE29）在体内和体外的治疗效果均优于噬菌体单一组。

参考文献

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基金资助

2023年吉林省博士后优先资助项目

吉林农业大学国家级大学生创新创业训练计划项目

吉林省自然科学基金(20220101311JC)