肺炎克雷伯菌噬菌体分离鉴定及抑菌效果研究

Isolation, identification and antibacterial effect study of Klebsiella pneumoniae phage

摘要

为探究噬菌体作为新型生物抗菌剂防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎和乳制品及其加工过程污染，以及对生物被膜清除的能力，以ATCC 700603为宿主菌从某牛场水样中分离得到1株肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnM-YP11，并通过透射电镜观察噬菌体形态特征；通过双层平板法测定噬菌体宿主谱；通过最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH稳定性测定噬菌体生物学特性；通过全基因组测序分析基因组的结构特征、比较其进化关系；通过结晶紫染色法和平板计数法测定噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果；通过牛奶试验分析该噬菌体对牛奶中肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明：1）从牛场水样中分离获得肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnM-YP11，能形成清晰透亮噬菌斑，透射电镜观察vB_KpnM-YP11具有肌尾噬菌体的典型结构。2）测定噬菌体宿主谱，表明vB_KpnM-YP11能够裂解 18/34 株牛源肺炎克雷伯菌。3）生物学特性结果表明vB_KpnM-YP11最佳感染复数为0.1，vB_KpnM-YP11感染宿主菌潜伏期为30 min，爆发期为50~90 min，110 min后进入平台期，平均裂解量为69 PFU/cell，在pH（3~11）和温度（4~60 ℃）范围内活性稳定。4）vB_KpnM-YP11基因组全长166 607 bp，GC含量为39.52%，注释结果显示共有276个ORF和15个tRNA，不含耐药基因及毒力基因。5）vB_KpnM-YP11最佳感染复数为0.1时，具有显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成能力。vB_KpnM-YP11效价为10⁸ PFU/mL，10⁹ PFU/mL能有效清除肺炎克雷伯菌生物被膜。在室温条件下，12 h内vB_KpnM-YP11使牛奶中细菌浓度下降98%。综上，本研究分离获得噬菌体vB_KpnM-YP11潜伏期短、裂解效率高，不仅能抑制和清除生物被膜，同时对牛奶中肺炎克雷伯菌也有显著的抑菌效果，具有作为肺炎克雷伯菌生物抗菌剂的应用潜力。

Abstract

The study was to explore the phage as a new type of biological antibacterial agent to control Klebsiella pneumoniae， which cause dairy cow mastitis and contaminate dairy products and their processing， and the ability of biofilm clearance.This study utilized ATCC 700603 as the host bacteria isolated a strain of Klebsiella pneumoniae phage vB_KpnM-YP11 from a water sample of a cattle farm and the morphological characteristics of the phage were observed by transmission electron. The host spectrum of phage was determined by double-layer plate method. The biological characteristics of phages were assessed through an optimal multiplicity of infection， one-step growth curve， as well as temperature and pH stability tests. The structual characteristics and evolutionary relutionary of the genome were analyzed by whole genome sequencing. The inhibitory and scavenging effects of phage on biofilms were determined using crystal violet staining and plate counting methods. The antibacterial effect of the phage on Klebsiella pneumoniae in milk was analyzed. The results showed that： 1） The Klebsiella pneumoniae phage vB_KpnM-YP11 isolated from the water samples of cattle farms could form clear and translucent plaques.The typical structure of tailed phage was observed by TEM. 2） Determination of host spectrum showed that vB_KpnM-YP11 could lyse 18/34 clinical isolates of Klebsiella pneumoniae from cattle. 3） The optimal multiplicity of infection （MOI） of this phage was 0.1. The one-step growth curve showed that the latent period was 30 min， and the average lysis amount was 69 PFU/cell. The phage was stable at 4-60 ℃ or pH 3-11. 4） The full-length genome of vB_KpnM-YP11 was 166 607 bp， and the GC content was 39.52%. The annotation results revealed that the phage contained 276 ORF and 15 tRNA， while lacking drug resistance and virulence genes. 5） When the MOI of vB_KpnM-YP11 was 0.1， it had the ability to inhibit the biofilm formation of Klebsiella pneumoniae. The mature biofilm were cleared by 10⁸ PFU/mL and 10⁹ PFU/mL. At room temperature， the bacterial concentration in milk decreased by 98% within 12 h.In conclusion， Phage vB_KpnM-YP11 with short incubation period and high lysis efficiency not only has a good lytic effect on Klebsiella pneumoniae in milk， but also can effectively remove the biofilm formed by Klebsiella pneumoniae. It has the potential to be used as a biological antibacterial agent for Klebsiella pneumoniae.

Graphical abstract

关键词

肺炎克雷伯菌 / 噬菌体 / 生物学特性分析 / 基因组分析 / 生物被膜

Key words

Klebsiella pneumoniae / phage / biological characteristics / genomic analysis / biofilm

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）属肠杆菌科，克雷伯菌属，是一种无运动性、无芽孢、有荚膜的革兰阴性杆菌，主要存在于肠道、呼吸道以及自然界中^［1］。其能引起人类及动物的多种疾病，如肺炎、脓毒血症、化脓性脑膜炎、奶牛乳房炎等，对人类及动物健康构成巨大威胁，是一种重要的人畜共患条件致病菌^［2］。在奶牛养殖业中，K. pneumoniae感染引起的奶牛乳房炎占临床乳房炎的10%~13%，仅次于金黄色葡萄球菌，链球菌和大肠杆菌^［3］。其中临床上高毒力高耐药K. pneumoniae的检出，包括碳青霉烯类耐药K. pneumoniae的出现，对畜牧养殖业和人类健康构成极大威胁^［4］。防治K. pneumoniae感染，对于奶牛养殖业的健康发展至关重要。已有研究表明生物被膜形成是K. pneumoniae主要耐药机制之一，被膜内细菌对抗生素耐药性比浮游菌高10~1 000倍^［5］。因此，需要寻找新型抗菌剂或抗生素替代物以治疗和控制K. pneumoniae引起的感染。

噬菌体是一种自然存在并能够特异性感染细菌的病毒。在100多年的实践应用过程中，国内外研究已证明噬菌体能够用于各种细菌性感染疾病的预防及治疗，特别是对耐药细菌具有良好的防治效果^［6］。Asif等^［7］利用噬菌体能有效清除食物基质中多重耐药K. pneumoniae生物被膜；Choo等^［8］利用噬菌体显著降低食品中大肠杆菌O157：H7的细菌数量，控制食品中的污染；Chen等^［4］利用噬菌体降低牛奶和鸡肉中K. pneumoniae的浓度，延长其储存时间等。牛奶中营养物质丰富，K. pneumoniae极易形成生物被膜附着在挤奶设备上，随着挤奶过程感染乳腺组织。目前，噬菌体用于K. pneumoniae感染的防治主要集中在人医临床，用于兽医临床和食品工业相对较少，但兽医临床和食品工业中使用的传统抗菌药和消毒剂难以清除K. pneumoniae，严重威胁人类与动物的健康安全^［9］。因此，本研究从大庆市某牛场水样中分离一株肺炎克雷伯菌噬菌体，对其进行生物学特性和全基因组分析，同时探究该噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果，并评估噬菌体在牛奶中的抑菌能力，旨在为噬菌体作为生物抗菌剂防控肺炎克雷伯菌感染提供参考。

1　材料与方法

1.1　主要试剂及仪器

LB培养基购自青岛海博生物科技有限公司；OMEGA病毒DNA提取试剂盒购自北京云肽生物科技有限公司；高速冷冻型微量离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；酶联免疫分析仪（杭州奥盛仪器有限公司）；透射电子显微镜JEM-2100PLUS（日本电子株式会社）。

1.2　试验菌株及污水样品

本试验所用菌株均由黑龙江八一农垦大学动物科技学院兽医公共卫生实验室保存，其中34株牛源肺炎克雷伯菌分离自黑龙江省各地规模化牛场；宿主菌为肺炎克雷伯菌ATCC 700603，其余菌株由本实验室保存；15份水样品采集自黑龙江省大庆市不同牛场。

1.3　噬菌体的分离纯化及形态观察

参照Pacios等^［10］的方法。将10 mL水样品在8 000 g离心10 min，取上清液与对数期的ATCC 700603在37 ℃下孵育12 h，通过0.22 µm滤器过滤除菌后得到噬菌体原液。取噬菌体原液和对数期的ATCC 700603各100 µL加入LB半固体培养基，混匀后倒入LB固体培养基，倒置放于37 ℃恒温培养8 h。挑取单个噬菌斑，采用双层平板法连续纯化多次，直至双层平板上的噬菌斑透亮，形态大小一致，即纯化完成。

采用磷钨酸负染法观察噬菌体的形态，取10 μL噬菌体悬液（10¹⁰ PFU/mL）滴加到铜网上，静置10 min。用滤纸吸去多余的噬菌体悬液，用2%的磷钨酸负染30 s，干燥后使用透射电镜观察噬菌体形态。

1.4　噬菌体的宿主谱

参照Asghar等^［11］的方法，采用双层平板法对噬菌体vB_KpnM-YP11的宿主谱进行测定。吸取不同细菌菌液100 µL，分别加入5 mL LB半固体培养基，混匀后迅速倒入LB固体培养基。凝固后，滴加10 µL噬菌体悬液，37 ℃恒温培养4 h，观察是否出现噬菌斑。

1.5　噬菌体的生物学特性分析

1.5.1　最佳感染复数测定

参照阮红日等^［12］的测定方法，将宿主菌培养至对数期，按照不同感染比例（0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100）将噬菌体和宿主菌混合，37 ℃振荡培养（160 r/min），4 h后采用双层平板法测定上清液中噬菌体效价，效价最高的比例即为最佳感染复数（Multiplicity of infection，MOI）。

1.5.2　一步生长曲线测定

根据最佳MOI=0.1，将噬菌体和对数期的宿主菌按照MOI为0.1进行混合，37 ℃振荡培养10 min后8 000 g 离心10 min，弃上清，加入LB液体培养基重悬菌体沉淀，重复3次以除去未吸附的噬菌体。用LB液体培养基重悬混匀后，37 ℃振荡培养，每间隔10 min收集样品并测定噬菌体效价，以取样时间为横坐标，噬菌体效价为纵坐标，绘制一步生长曲线。裂解量（PFU/mL）=裂解末期噬菌体效价/初始宿主菌浓度。

1.5.3　热稳定性和pH稳定性测定

将效价约为10⁹ PFU/mL的噬菌体悬液置于不同温度（4、25、37、40、50、60、70和80 ℃）和不同pH（2~12）条件下，孵育1 h。采用双层平板法测定噬菌体效价。

1.6　噬菌体基因组提取和分析

噬菌体vB_KpnM-YP11的基因组提取参照Zali等^［13］的方法。使用OMEGA病毒DNA提取试剂盒提取噬菌体基因组，送至武汉博越致和生物公司进行全基因组测序。使用RAST（http： //rast.nmpdr.org/）对噬菌体的全基因组进行功能注释，使用DNASTAR软件分析（G+C）%含量，并将全基因组序列提交到GenBank数据库中进行BLAST同源比对。使用在线数据库（https： //cge.cbs.dtu.dk/services/Res Finder/）预测噬菌体基因组中携带的毒力基因和耐药基因。根据病毒分类委员会（ICTV）分类报告，利用NCBI（http： //blast.ncbi.nlm.nih.gov）数据库下载不同噬菌体末端酶大亚基序列，用MEGA 11软件通过邻接法构建系统发育树^［14］。

1.7　噬菌体对生物被膜的抑制效果

将噬菌体悬液和对数期的肺炎克雷伯菌分别按不同MOI值加入至96孔板中，每个孔中加入200 μL混合液，SM Buffer作为阴性对照组，置于37 ℃恒温培养24 h。将上述培养液吸出，每孔加入200 μL的PBS清洗3次；每孔加入200 μL甲醇（95%）固定15 min，然后吸出甲醇，自然晾干；再每孔加入200 μL 1%的结晶紫，室温下染色15 min；用缓流水冲洗2~3次，37 ℃培养箱中烘干；最后每孔加入200 μL的33%冰乙酸作用20 min；将处理好的96孔板置于酶标仪中，测定溶液在595 nm处的吸光值；每孔做3个重复，并取平均值。

1.8　噬菌体对生物被膜的清除效果

参照Hon等^［15］的方法，在96孔板上培养成熟的肺炎克雷伯菌生物被膜，用PBS洗涤3次去除游离细菌，之后每孔加入200 μL效价为10⁸ PFU/mL和10⁹ PFU/mL的噬菌体，SM Buffer作为阴性对照组，置于37℃培养24 h。每孔加入200 μL的PBS清洗3次后，刮取黏附在孔板内的生物被膜通过平板计数法测定生物被膜内细菌数量。参考1.7结晶紫染色法测定噬菌体对生物被膜的清除效果。生物被膜内细菌清除率=（对照组－试验组）/对照组×100%。

1.9　噬菌体在牛奶中的抑菌效果

参照张娥^［16］的方法，评估噬菌体在牛奶中抑制肺炎克雷伯菌的能力。将肺炎克雷伯菌（1×10⁵ CFU/mL）和噬菌体（1×10⁸ PFU/mL和1×10⁹ PFU/mL）分别混合后加入到20 mL牛奶中振荡混匀，以添加SM Buffer为阴性对照组。在室温下孵育3、6 和12 h后。取100 µL样品按10倍梯度稀释，进行菌落计数。

1.10　数据处理与分析

试验结果以平均值±标准差标识，数据采用GraphPad Prism 9统计学软件。所有试验重复3次，多组比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2　结果与分析

2.1　噬菌体的分离纯化及形态观察

以肺炎克雷伯菌ATCC 700603为宿主菌，从牛场水样中分离获得1株肺炎克雷伯菌噬菌体，命名为vB_KpnM-YP11。vB_KpnM-YP11在双层平板形成透亮、边缘清晰噬菌斑，直径约为1~2 mm（图1（a））。

通过透射电镜观察，vB_KpnM-YP11具有肌尾噬菌体的典型结构，头部直径约为 （80±5） nm，尾部长约（110±5） nm（图1（b））。

2.2　噬菌体的宿主谱

由表1可知，双层平板法结果显示vB_KpnM-YP11能在18株测试的肺炎克雷伯菌双层平板上产生噬菌斑，vB_KpnM-YP11对临床分离的牛源肺炎克雷伯菌裂解率为53% （18/34）。对沙门菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等未裂解，表明vB_KpnM-YP11具有较强的特异性。

2.3　噬菌体生物学特性

通过双层平板法测定vB_KpnM-YP11最佳MOI为0.1（图2（a））；根据MOI=0.1绘制一步生长曲线如（图2（b））所示，vB_KpnM-YP11的潜伏期约为30 min，而爆发期为50~90 min，110 min后进入平台期，裂解量为69 PFU/cell。vB_KpnM-YP11在pH值为3~11时活性保持稳定（图2（c））；当噬菌体在pH=2的酸性环境或者pH=12的碱性环境孵育1 h后，噬菌体活性完全丧失。vB_KpnM-YP11在4~50 ℃内活性保持稳定，随着温度的逐渐升高，在60 ℃条件下孵育1 h后，噬菌体滴度下降24%，而在高温70和80 ℃时vB_KpnM-YP11完全失活（图2（d））。

2.4　噬菌体的基因组分析

如图3所示，噬菌体vB_KpnM-YP11全基因组长度为166 607 bp，基因组为线性，其核酸序列NCBI登录号为PP531540。基因组中A、C、G和T碱基含量分别为30.74%、18.88%、20.64%和29.74%，G+C含量为39.52%，低于肺炎克雷伯菌株平均GC的含量（57.7%）。共注释276个开放阅读框（ORF），其中大部分基因编码功能未知的假定蛋白，仅53个ORF与已知的功能基因有较高的相似性，包括噬菌体结构基因、DNA复制和细菌裂解相关酶的编码基因等。未发现编码整合酶、切除酶或阻遏物等与溶源有关的基因，表明vB_KpnM-YP11是一株烈性噬菌体。vB_KpnM-YP11基因组中发现15个tRNA，不携带耐药基因和毒力基因，具有较好的应用前景。如图4所示，vB_KpnM-YP11与肺炎克雷伯菌噬菌体KMI13亲缘关系最近，且2株噬菌体均为同一属成员，根据国际病毒委员会（ICTV）的分类，噬菌体vB_KpnM-YP11为Myoviridae科Jiaodavirus属成员。

2.5　噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果

生物被膜抑制试验结果表明（图5（a）），不同MOI的vB_KpnM-YP11均可显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成（P＜0.001）。生物被膜清除试验结果表明（图5（b）），vB_KpnM-YP11与成熟的肺炎克雷伯菌生物被膜共孵育24 h后，效价为10⁸ PFU/mL和10⁹ PFU/mL的vB_KpnM-YP11均可以有效破坏生物被膜的完整性（P＜0.001）。同时，图（5（c））平板计数结果表明vB_KpnM-YP11处理后，生物被膜内的细菌数量分别下降93.86%（1.22 lg CFU/mL）和98.14%（1.74 lg CFU/mL）（P＜0.001）。

2.6　噬菌体在牛奶中的抑菌作用

由（图6（a））可知，室温条件下，vB_KpnM-YP11在3 h内使牛奶中的活细菌数量分别下降 0.93 lg CFU/mL（MOI=1 000）和1.08 lg CFU/mL（MOI=10 000），6 h时内活细菌数量由 6.86 lg CFU/mL分别下降至5.64 lg CFU/mL（MOI=1 000）和5.28 lg CFU/mL（MOI=10 000）。随着vB_KpnM-YP11处理时间的增加，细菌数量减少。vB_KpnM-YP11作用12 h后，牛奶中肺炎克雷伯菌数量分别降低1.4 lg CFU/mL（降低96%，MOI=1 000）和1.76 lg CFU/mL（降低98%，MOI=10 000），结果表明vB_KpnM-YP11在牛奶中对肺炎克雷伯菌均具有良好的抑制作用（P＜0.01），并且牛奶并不会对噬菌体杀菌活性产生影响（P＜0.01）（图6（b））。

3　讨　论

K. pneumoniae引起的乳房炎症状严重，难以治疗，给奶牛养殖业造成巨大经济损失^［17］。随着抗菌药物的广泛使用乃至滥用，导致药物残留问题愈发严峻，使得K. pneumoniae耐药性逐渐增强，碳青霉烯类耐药K. pneumoniae的检出率更是逐年升高，新型药物研发滞后，临床治疗面临着更加严峻的挑战^［18］。因此迫切需要开发新型抗菌剂以防治K. pneumoniae造成的感染。

噬菌体广泛分布在生态系统中，易于获得并且具有特异性靶向作用，裂解宿主菌时几乎不会影响其他菌群，现已广泛应用在畜牧养殖业、食品工业和临床医学中^［4］。已有研究表明，噬菌体对细菌生物被膜具有抑制和清除作用，有潜力作为新型抗菌剂防治K. pneumoniae造成的感染^［19］。

本研究从牛场水样中成功分离获得1株肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体vB_KpnM-YP11，该噬菌体对肺炎克雷伯菌ATCC 700603和牛源肺炎克雷伯菌表现出较强的特异性。基因组分析表明，噬菌体vB_KpnM-YP11不携带任何已知的溶源性相关基因、毒力基因和耐药基因，表明该噬菌体在实际应用中具有较好的生物安全性。噬菌体vB_KpnM-YP11的生物学特性表明，其最佳感染复数为0.1，潜伏期为30 min，爆发期为50~90 min，在4~60 ℃和pH 3~11范围内活性保持稳定。良好的环境耐受能力和高效的裂解效率是噬菌体vB_KpnM-YP11作为生物抗菌剂的应用基础^［20］。

K. pneumoniae菌毛和胞外多糖赋予该菌黏性表型，能够黏附在生物和非生物表面，并极易形成生物被膜^［21］。细菌生物被膜的产生为细菌提供了天然的保护屏障，这也是其主要耐药机制之一。在奶牛养殖过程中，奶牛感染K. pneumoniae后，产出牛奶中含有K. pneumoniae，严重影响乳品质^［17］。且K. pneumoniae在该过程中很可能黏附在挤奶器等设备上，若其形成生物被膜后难以清除，易在养殖场大规模传播，对其他健康奶牛也造成严重威胁。本研究通过结晶紫染色法和平板计数法，对噬菌体vB_KpnM-YP11抑制和清除细菌生物被膜的能力进行测定，结果表明，在不同MOI值条件下，vB_KpnM-YP11均能够显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成。vB_KpnM-YP11效价为10⁸ PFU/mL和10⁹ PFU/mL能有效清除肺炎克雷伯菌生物被膜。表明vB_KpnM-YP11具有预防和控制肺炎克雷伯菌及其生物被膜感染的能力。以牛奶作为食物基质，评价噬菌体在牛奶中的抑菌效果。虽然牛奶中含有大量的乳脂和乳蛋白等大分子物质能够影响噬菌体与细菌相互作用^［22］，但vB_KpnM-YP11在室温条件下，12 h内能够显著降低牛奶中细菌数量，噬菌体vB_KpnM-YP11虽然不能完全清除乳制品中的细菌，但可以抑制细菌生物被膜的形成，显著减少细菌数量，有潜力作为乳制品杀菌消毒技术补充。未来可考虑将噬菌体与其它清洁剂、消毒剂联合应用，保障乳制品生产、加工、运输及卫生安全，以上研究结果表明，vB_KpnM-YP11有潜力作为生物抗菌剂防控乳制品加工生产过程中K. pneumoniae污染。

4　结　论

本研究分离获得的vB_KpnM-YP11具有爆发期短、裂解量高和耐受性强等特点。vB_KpnM-YP11不仅对K. pneumoniae生物被膜具有很好的抑制和清除作用，还能够显著降低牛奶中的细菌数量，说明vB_KpnM-YP11有潜力作为生物抗菌剂防控乳制品加工生产过程中K. pneumoniae污染。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(31802226)

黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2022C072)

黑龙江省牛病防制重点实验室开放课题(PCBD201710)