捻转血矛线虫blister-5基因序列特征及表达特性分析

Analysis of sequence characteristics and expression properties of blister-5 in Haemonchus contortus

摘要

为明确捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）中Kunitz型蛋白BLI-5的表达特性，利用生物信息学软件对其基因结构、保守结构域、进化关系和蛋白质三维结构进行分析；基于WormBase数据库，分析捻转血矛线虫发育过程各个阶段Hc-bli-5与Hc-bli-4的相对转录丰度；通过构建原核表达载体诱导表达重组蛋白，并制备多克隆抗体，采用虫体组织免疫荧光试验分析目标蛋白（Hc-BLI-5）在捻转血矛线虫中的组织定位情况。结果显示：1）Hc-bli-5基因全长2 088 bp，由4个外显子和3个内含子组成，Hc-BLI-5共有195个氨基酸，132~192位氨基酸为Kunitz-type super family结构域，是一种丝氨酸蛋白酶抑制因子。2）进化树分析发现，丝氨酸枯草杆菌蛋白酶超家族蛋白BLI-5在寄生线虫和自由生活线虫中均有较为密切的进化关系，捻转血矛线虫与柏氏血矛线虫（Haemonchus placei）在该基因的进化关系上最为接近，聚集在进化树的同一小分支上。3）蛋白质结构对比分析显示，捻转血矛线虫和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）BLI-5具有一定的相似性，尤其是Kunitz结构域。4）各时期转录丰度检测显示，Hc-bli-5与Hc-bli-4的表达趋势有一定的重叠，提示二者可能互相作用、参与共同的生物学过程。5）组织定位研究表明，Hc-BLI-5蛋白主要表达于捻转血矛线虫的表皮和肌肉组织。综上，Hc-bli-5可能与Hc-bli-4相互作用参与捻转血矛线虫蜕皮过程。本研究明确了Hc-bli-5的序列特征及其蛋白的表达特性，为探索其是否参与捻转血矛线虫蜕皮过程及其作用机制提供了理论依据。

Abstract

The study was to identify the expression properties of the Kunitz-type protein BLI-5 in Haemonchus contortus. Firstly， analysis of its gene structure， conserved domain， evolutionary relationships and protein three-dimensional structure using bioinformatics software were conducted； Secondly， the relative transcript abundance of Hc-bli-5 and Hc-bli-4 was analyzed based on WormBase database at each developmental stage of H. contortus； Subsequently， a prokaryotic expression vector to obtain recombinant protein and prepared polyclonal antibodies were constructed， while tissue distribution of the protein candidates in the worm was analyzed by the immunolocalization assay. The results revealed that： 1）The Hc-bli-5 gene has a total of 2 088 bp， and consisted of 4 exons and 3 introns.Hc-BLI-5 has a total of 195 amino acids， with 132-192 aa forming a Kunitz-type super family domain， which is a serine proteinase inhibitor. 2） Phylogenetic tree showed that BLI-5 has a close evolutionary relationship in both parasitic and free-living nematodes， and the evolutionary relationship between H. contortus and Haemonchus placei is most closely aligned， clustering together on the same minor branch of the phylogenetic tree； 3） Comparative analysis of protein structures indicated that Hc-BLI-5 and Ce-BLI-5 shared certain similarities， especially in the Kunitz domain.4） Transcript abundance analysis at each developmental stage showed that the expression trend of Hc-bli-5 and Hc-bli-4 overlapped， suggesting that they may interact with each other and participate in common biological process. 5） Immunolocalization showed that BLI-5 was distinctly expressed at the cuticle and muscle tissue of worm. In summary， Hc-bli-5 may interact with Hc-bli-4 and participate in the molting process of H. contortus. This study clarified the sequence characteristics and expression properties of Hc-bli-5， providing a theoretical basis for exploring its involvement in the molting process and mechanism in H. contortus.

Graphical abstract

关键词

捻转血矛线虫 / 蜕皮 / Hc-bli-5 / 序列特征 / 表达特性

Key words

Haemonchus contortus / molting / Hc-bli-5 / sequence characteristics / expression property

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属于圆线目、毛圆线虫科、血矛线虫属，广泛分布于世界各地且感染率高^［1］ ，是牛羊等反刍动物最主要的胃肠道寄生线虫之一^［2］。捻转血矛线虫感染主要引发宿主贫血、下颌水肿、消瘦等慢性消耗症状，严重时也可导致死亡，对畜牧业造成严重的经济损失^［3］。由于目前缺乏高效的商业化疫苗，捻转血矛线虫病的防治依赖于使用抗蠕虫化学药物，但是近年来耐药虫株大量出现^［4-6］ ，严重限制了这些药物的防治效果。如课题组前期研究发现，捻转血矛线虫ZJ株对多种常用抗蠕虫药（如伊维菌素、噻苯达唑、左旋咪唑等）产生了不同程度的耐药性^［7-9］。因此，寻找新的药物候选靶点，以此筛选或开发新型药物，是目前血矛线虫病防控的重要研究方向。

蜕皮是线虫发育必经的生物进程，参与这个过程的关键调控因子很可能是潜在的药物干预靶标。线虫生命周期中关键的过程包括虫卵孵化、幼虫蜕皮、滞育等，其中蜕皮是所有线虫最重要的发育过程之一，且从虫卵发育至成虫至少经历4次^［10］。蜕皮过程受到多种酶（如丝氨酸蛋白酶、脯氨酸羟化酶、二硫化物异构酶）及酶抑制因子（如丝氨酸蛋白酶抑制因子、胰蛋白酶抑制因子等）精准调控^［11-13］。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中存在一种丝氨酸蛋白酶抑制因子BLI-5，可能通过作用BLI-4（一种丝氨酸蛋白酶）参与蜕皮过程，并能够引起水泡样表型^［12］。Page等^［14］研究发现，秀丽隐杆线虫bli-5突变体出现起泡样表型，并且过表达虫体出现严重的蜕皮缺陷，具体表现比如L1的旧表皮仍然存留在L2幼虫的头部，无法脱落。同时，Stepek等^［15］对正常的秀丽野生株进行bli-5干扰试验发现，其中43%的成虫表皮出现明显的起泡样表型，除此之外，当对bli-4突变株进行bli-5干扰试验，将会引起73%的成虫出现起泡样表型，从而推测这2个基因的表达产物有可能存在相互作用。课题组前期研究发现，捻转血矛线虫中存在BLI-5的同源物（Hc-BLI-5），但该蛋白是否在捻转血矛线虫蜕皮过程中发挥作用有待研究。基于此，本研究拟对Hc-bli-5序列特征以及表达特性进行分析，为后续深入研究Hc-bli-5在蜕皮等生物学过程中的功能以及评价其作为干预靶标的可能性奠定前期理论基础。

1　材料与方法

1.1　捻转血矛线虫虫株、质粒和菌株

捻转血矛线虫浙江株（ZJ strains）长期在湖羊体内传代由本实验室培养并保存，原核表达载体pET-32a质粒、大肠埃希菌（Escherichia coli）TOP10和Rosetta感受态菌株均由本实验室制备并留存。

1.2　主要试剂

LA Taq酶、EcoR I限制性内切酶、Hind III限制性内切酶、pMD19-T载体购自日本TaKaRa公司；反转录试剂盒（HiScript® II Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper））、实时荧光定量PCR（qPCR）检测试剂盒（ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix）均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；CY3标记山羊抗小鼠荧光二抗（PN0086）购自武汉皮诺飞生物科技有限公司；细胞核染料4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）购自美国Sigma公司。

1.3　 Hc-bli-5序列特征分析

Hc-bli-5基因序列由实验室通过靶向筛选研究发现并获得，利用生物信息软件对所获得的序列进行基因结构分析，氨基酸同源性分析，蛋白的功能域预测和系统进化树分析。用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）与InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/-sequence/）数据库对Hc-BLI-5蛋白序列进行功能域和活性位点预测分析，SignalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/-services/SignalP/）和德肽生物信号肽分析预测可能的信号肽；然后将捻转血矛线虫Hc-bli-5基因的氨基酸序列通过NCBI-BLAST平台，获得其同源基因并分析氨基酸相似性，并运用MEGA11.0软件分析其同源基因之间的进化关系。同时，通过AlphaFold2程序对Hc-BLI-5和Ce-BLI-5的蛋白三维结构及其对应的BLI-5 Kunitz结构域三维结构进行预测分析。

1.4　各时期转录水平分析与转录丰度检测

收集捻转血矛线虫发育过程各时期（包括虫卵、一期（L1）、二期（L2）、三期（L3）、四期（L4）幼虫和成虫阶段）的样本，分别提取RNA后反转录为cDNA，以cDNA为模板，以Hc-18s为内参基因，利用特异性引物进行实时荧光定量PCR检测，引物序列见表1，采用2^-ΔΔCt 法对Hc-bli-5基因转录水平进行相对定量分析；采用One-way ANOVA和t检验分析，当P>0.05时差异不显著，当P<0.05时差异显著，当P<0.01时差异极显著。基于WormBase数据库收录的平均每一百万个转录本中对应于特定基因转录本的数量（Transcripts per million， TPM），分析bli-5与bli-4 2个基因分别在秀丽隐杆线虫、捻转血矛线虫发育过程各时期相对转录丰度。

1.5　多克隆抗体制备

以捻转血矛线虫成虫cDNA为模板，PCR扩增Hc-bli-5基因，引物序列见表1。将扩增产物连接至pMD19-T载体，转化E. coli TOP 10感受态细胞后挑取阳性克隆进行测序鉴定。构建pET-32a-Hc-bli-5表达质粒并转化Rosetta感受态细胞，挑选阳性克隆单菌落进行菌液PCR鉴定，引物序列见表1。使用0.001 mol/L IPTG诱导表达重组蛋白，于诱导0、2、4、6和8 h收取菌液样本，分别向诱导不同时间后的菌液加入PBS缓冲液进行冰浴超声波裂解，分别收集裂解后的上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳验证，以确定最佳诱导时长及重组蛋白的溶解特性。扩大培养后使用亲和镍柱纯化重组蛋白，按照常规免疫程序对ICR小鼠（每组6只）进行3次免疫，末次免疫后第7天尾静脉采血，利用酶联免疫吸附测定法（ELISA）对血清多克隆抗体效价进行检测，第7天眼眶采血，37 ℃静置1 h，4 ℃过夜，收集析出血清。研磨法提取H. contortus全虫蛋白，经蛋白质印迹法（Western blot， WB）验证抗体的结合能力。

1.6　间接荧光免疫组织化学分析

将捻转血矛线虫成虫置于4%多聚甲醛溶液中固定7 d，用不同浓度梯度的酒精逐级脱水，随后包埋于石蜡中并切割成5 μm厚度的蜡片。选取组织结构完整的切片，经二甲苯脱蜡和酒精水化后，于100 ℃柠檬酸盐抗原修复溶液（pH 6.0）中浸泡20 min，滴加10%山羊血清，4 ℃封闭过夜。滴加200倍稀释的自制多克隆抗体孵育1 h，用PBS洗涤虫体后滴加100倍稀释的CY3标记山羊抗小鼠荧光二抗（PN0086），于37 ℃条件下避光孵育1 h。用PBS洗涤后滴加500倍稀释的DAPI，37 ℃孵育20 min，以进行核染。洗涤后滴加50%甘油进行封片，使用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

2　结果与分析

2.1　 Hc-bli-5序列特征

该基因DNA全长2 088 bp，由4个外显子和3个内含子组成（图1（a））。Hc-BLI-5蛋白由195个氨基酸组成，SignalP-5.0分析其N端存在一个信号肽（1-17aa： MKTALLSLILFSCHIWA），表明其为分泌型蛋白。该蛋白含有一个Kunitz-type super family（BPTI）结构域（132~192 aa），是一种丝氨酸蛋白酶抑制因子，预示了与BLI-4互作的可能。经WormBase Compara同源基因分析，在Ⅲ类和Ⅴ类线虫中存在Hc-BLI-5蛋白的同源物，包括柏氏血矛线虫（H. placei）、多形螺旋线虫（Heligmosomoides polygyrus）、环纹背带线虫（Teladorsagia circumcincta）、有齿食道口线虫（Oesophagostomum dentatum）、锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum）、十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale）、美洲板口线虫（Necator americanus）、广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis）、哥斯达黎加管圆线虫（Angiostrongylus costaricensis）、巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis）及秀丽隐杆线虫（C. elegans）。其中，与柏氏血矛线虫（H. placei）的 bli-5基因相似度最高，为99.42%。进化树分析表明，捻转血矛线虫与柏氏血矛线虫的bli-5聚集在进化树的同一小分枝上（图1（b））。其同源物的蛋白结构和功能域与Hc-BLI-5 相似，除环纹背带线虫含有EB功能域之外，其余同源物都含有BPTI功能域（图1（c））。基于蛋白三维结构分析表明，Hc-BLI-5和Ce-BLI-5的蛋白三维结构具有一定的相似性，尤其是Kunitz结构域（图1（d））。

2.2　 Hc-bli-5转录特性

Hc-bli-5与Hc-bli-4在捻转血矛线虫的各发育阶段中均有不同水平转录，并且两者具有类似的表达模式。qPCR结果表明，Hc-bli-5在捻转血矛线虫的各发育阶段中均有不同的转录水平，在L3阶段的转录水平最高，而成虫阶段的转录水平最低（图2）。转录丰度分析表明，bli-5与bli-4 两基因在秀丽隐杆线虫和捻转血矛线虫中都具有较为类似的表达模式，这一转录特性在捻转血矛线虫中尤为明显（图3）。这对基因在捻转血矛线虫的虫卵期、L1期和L3期均出现了表达拐点，转录水平从虫卵期到L1期都呈现迅速下降趋势，在L1期出现拐点后，于L3期达到最高，L3期之后又都出现下降，不同的是，Hc-bli-4在L3期之后仍会有起伏的增加，而Hc-bli-5在L3期之后一直呈下降趋势，在成虫期表达最低。由于基因的表达出现在表型发生之前，可以推测Hc-bli-5可能在捻转血矛线虫虫卵至L3期与Hc-bli-4共同参与捻转血矛线虫的蜕皮过程。

2.3　多克隆抗体制备

克隆获得Hc-bli-5基因编码序列，长度为588 bp（图4（a）），成功构建pET-32a-Hc-bli-5原核表达质粒。诱导后重组蛋白rHc-BLI-5主要表达在包涵体中，100 mmol/L咪唑洗脱液对该重组蛋白有较好的洗脱和纯化效果（图4（b））。ELISA检测第3次免疫后，小鼠血清中rHc-BLI-5多克隆抗体的效价为1∶2 048 000（图4（c））。经Western blot证实，该多克隆抗体可以识别重组蛋白Hc-BLI-5及捻转血矛线虫天然蛋白Hc-BLI-5（图4（d）），有较好的敏感性和特异性，可用于后续基因表达特性分析。

2.4　间接荧光免疫组织化学分析

利用制备的鼠抗rHc-BLI-5多克隆抗体进行捻转血矛线虫雌虫成虫阶段天然蛋白Hc-BLI-5的组织分布研究，结果显示在表皮有较强的红色荧光信号，且表皮与肌肉组织的细胞核有点状蓝色荧光信号，证明Hc-BLI-5蛋白表达后主要分布于捻转血矛线虫的表皮和肌肉组织（图5）。

3　讨　论

蜕皮是线虫生长发育周期中必不可少的一个环节，包括3个重要部分，即皮层溶离、新皮合成、旧皮脱落，在这3个阶段均可发生蜕皮障碍。其中，皮层溶离与新皮合成环节涉及多种蛋白酶，在这2个阶段更容易发生蜕皮障碍^{［10，16］}。

皮层溶离作为蜕皮过程的第一步，该过程中需要不同的蛋白酶及其抑制因子降解旧表皮与皮下组织之间的连接，目前已知发挥该功能的蛋白酶有BLI-4、NAS-36、NAS-37、CPZ-1、BLI-5和MLT-11^［16-19］。新皮合成涉及胶原合成、加工与交联，该过程需要DPY-18、PHY-2、PDI-2、BLI-3和BLI-4和DPY-31等关键的酶来实现^{［13，20-22］}。在新皮合成这个复杂的过程中，参与新皮合成过程的某一基因一旦缺失，将致使虫体无法合成新皮，从而引起蜕皮障碍。目前已知dpy-18或phy-2的缺失会引起虫体粗短，pdi-2缺失会导致胚胎致死、无法孵化；sec-23缺失会引起蜕皮缺陷，即虫体的头部卡在旧的角质层内，或是形成的新表皮十分脆弱；bli-3和bli-4的缺失均会导致成虫表皮起泡样的表型^［23］。

线虫蜕皮过程中皮层溶离和新皮合成2个阶段受到bli-5的调控。近年来，在秀丽隐杆线虫中发现了blister-5（bli-5）基因，其编码的蛋白BLI-5是一种库尼茨（Kunitz）型丝氨酸蛋白酶抑制因子，在皮层溶离的过程中能够防止BLI-4（一种丝氨酸蛋白酶）过度降解旧表皮和皮下组织，进而参与秀丽隐杆线虫蜕皮过程^{［14-15，24］}。目前，课题组已在捻转血矛线虫中鉴定获得了BLI-5的同源物，本研究发现其与秀丽隐杆线虫的BLI-5序列相似性较高且蛋白结构相似，不仅如此，二者基因的转录模式也有类似之处，与秀丽隐杆线虫中的BLI-5一样，捻转血矛线虫中不同发育时期bli-5和bli-4的转录丰度具有相似的震荡性变化，这预示着两者功能也存在相似的可能。除此之外，研究表明Hc-BLI-5含有信号肽，是分泌型蛋白，且主要表达在表皮和肌肉组织，说明具有分泌至指定位置参与皮层溶离和新皮合成的可能性。综上，可以推测Hc-BLI-5与Ce-BLI-5相似，可能通过作用于BLI-4而参与线虫蜕皮过程。

4　结　论

本研究明确了Hc-bli-5的序列特征与表达特性，发现Hc-BLI-5与秀丽隐杆线虫的同源物具有蛋白结构的相似性，Hc-bli-5与Hc-bli-4有类似的时期转录特异性，Hc-BLI-5定位于捻转血矛线虫的表皮，这些结果表明Hc-bli-5可能与Hc-bli-4相互作用参与蜕皮过程，为进一步阐明其在捻转血矛线虫及其他相关线虫中的作用机制奠定基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32202829)

国家自然科学基金项目(32172877)

浙江省自然科学基金项目(LZ22C180003)

浙江省自然科学基金项目(LQ23C180006)